Summary
大腸菌は、出生前後に細菌を摂取した新生児に敗血症を引き起こします。大腸菌が腸管から血流に移動する能力に関与するプロセスは、よく理解されていません。このin vitroモデルは、大腸菌株が腸上皮細胞を通過する能力を評価します。
Abstract
新生児は、出産前後に腸管にコロニーを形成する母体の大腸菌株を摂取します。腸内を移動する能力を持つ大腸菌株は、新生児の血流に侵入し、生命を脅かす菌血症を引き起こします。ここで紹介する方法論は、半透性インサート上で増殖させた分極腸上皮細胞を利用して、in vitroで新生児大腸菌血症分離株のトランスサイトーシスを評価します。この方法は、コンフルエントに成長し、タイトジャンクションとデスモソームを形成する能力を有する確立されたT84腸細胞株を使用します。コンフルエントに達した後、成熟したT84単層は経上皮抵抗(TEER)を発症し、電圧計を使用して定量化できます。TEER値は、腸単層を横切る細菌を含む細胞外成分の傍細胞透過性と逆相関しています。一方、細菌の経細胞通過(トランスサイトーシス)は、必ずしもTEER測定値を変化させるわけではありません。このモデルでは、腸単層を横切る細菌の通過が感染後最大6時間定量化され、傍細胞透過性を監視するためにTEERの繰り返し測定が行われます。さらに、この方法は、分極上皮を横切る細菌トランスサイトーシス中のタイトジャンクションおよび他の細胞間接着タンパク質の構造変化を研究するための免疫染色などの技術の使用を容易にします。このモデルの使用は、新生児大腸菌が腸上皮を横切って菌血症を引き起こすメカニズムの特性評価に貢献します。
Introduction
大腸菌は、新生児の早期発症型敗血症の最も一般的な原因です1、2、3。新生児大腸菌血症の死亡率は40%に達する可能性があり、髄膜炎は重度の神経発達障害に関連する可能性のある合併症です2。新生児による母体の大腸菌株の摂取は、新生児菌血症を引き起こす可能性があります。このプロセスは、動物モデル2、4で再現されています。摂取されると、病原菌は新生児の腸管腔から腸関門を越えて血流に入り、敗血症を引き起こします。菌血症を産生する新生児侵襲性大腸菌株は、腸上皮細胞に侵入する能力が異なる1,5。しかしながら、浸潤後に腸上皮をトランスサイトーゼするそれらの能力は完全には特徴付けられていない。
この腸管トランスサイトーシスモデルは、腸上皮を横切る細菌の通過をエミュレートするための有用なin vitro法である。この原稿で提示された方法の全体的な目標は、腸上皮をトランスサイトーゼする新生児大腸菌分離物の能力を比較することです。ここで説明するモデルは、不死化ヒト腸腺癌細胞であるT84細胞を利用する6,7。T84細胞は、2つの別々のコンパートメントを有する半透膜上でコンフルエントに増殖する。この技術を使用する理論的根拠は、in vivoで起こるように、これらの腸細胞が分極し、成熟したタイトジャンクションを発達させることです6,8。膜と接触する側が基底側となる。細胞の反対側は頂端側になり、摂取された病原体が付着して侵入する腸管腔に似ています。トランスウェル膜は細菌に対して透過性ですが、分極した腸細胞はタイトジャンクションを形成し、細菌の傍細胞運動を損ないます9。したがって、この方法は、経細胞経路を含む細菌性トランスサイトーシスの過程を研究するためにヒト細胞株を利用する制御されたインビトロ環境の利点を提供する。腸上皮を横切る細菌のトランスサイトーシスを調査するための他の方法が存在するが、ここで紹介するトランスウェル法は、より容易でアクセスしやすい方法を提供する。Ussingチャンバーシステムに設置されたex vivoサンプルを利用する技術などの代替技術が利用可能です。ただし、特に研究が人間の生理学を研究することを意図している場合は、簡単にアクセスできない可能性のある組織標本を利用します10。腸管オルガノイドは、宿主-細菌相互作用を研究するためのin vitro代替物の別の例を表しています11。オルガノイド単分子膜は、細菌のトランスサイトーシスを研究するためにトランスウェルシステムでも使用できますが、幹細胞の単離と増殖、および分化を誘導するための特定の成長因子の使用が必要です12。したがって、それらの使用は、この原稿に記載されているトランスウェル法と比較して、より時間がかかり、より大きなコストを伴う。
このin vitroトランスウェルシステムを用いた腸上皮を横切る細菌の通過の評価は、様々な病原体に対して成功裏に行われている。これらの研究は、分極した腸上皮を横切る細菌のトランスサイトーシスを特徴付けるためにT84細胞を使用するトランスウェルシステムの有用性を示しています13、14、15。しかしながら、菌血症産生新生児大腸菌株のトランスサイトーシス能を比較するためのこのトランスウェル法の適用は詳細に説明されていない。この原稿は、信頼性が高く使いやすく、高すぎるリソースを必要としない標準的なTranswellプロトコルを他の研究者に提供します。
腸上皮をトランスサイトーゼする新生児侵襲性 大腸菌 株の能力を比較するために、腸上皮単層の頂端側に、既知の数の細菌細胞を感染させることができる。インキュベーション後、上皮の基底側の培地を回収し、細菌を定量して、細菌トランスサイトーシスの量を経時的に決定することができます。この原稿では、提示された方法を利用して、菌血症で入院した新生児から回収された新生児 大腸菌 臨床株のトランスサイトーシス能力を研究しています。トランスサイトーシス研究のためのこれらの新生児臨床分離株の選択のための選択基準は、以前に公開されている1、2、16。この方法が異なる 大腸菌 株を用いて行われる場合、それらのトランスサイトーシス能力を比較することができる。このプロセスを通じて、腸管トランスサイトーシスモデルは、新生児菌血症の発症に至る多段階のプロセスに寄与する 大腸菌 の病原性因子を特徴付けるための貴重なデータを提供します。
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Protocol
注意: 汚染を避けるために、バイオセーフティレベル2(BSL-2)の安全キャビネットでT84細胞、細菌、プレート、および試薬のすべての操作を実行してください。滅菌T84細胞、感染したT84細胞、および大腸菌を含むすべての作業には、別々のエリアとインキュベーターを使用してください。ここに記載されている方法でテストされた臨床大腸菌分離株は、私たちの施設の治験審査委員会のガイドラインに従って取得されました1,16。
1. T84細胞を用いたトランスサイトーシスインサートの調製(実験の約1〜2週間前)
- ダルベッコ改変イーグル培地:ハムのF-12栄養混合物(1:1、最終濃度:各50%)、5%ウシ胎児血清、および1%(100 U / mL)ペニシリン/ストレプトマイシン二重抗生物質混合物からなる組織培養培地(TCM +抗生物質)でアメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC)T84細胞を増殖させます。細胞を5%CO2と共に37°Cでインキュベートする。
注:ペニシリン/ストレプトマイシンを含まないこの培地製剤のバリエーション(抗生物質なしのTCM)は、手順の後のステップ(セクション2以降)に使用されます。各ステップで正しい処方が使用されていることを確認してください。 - バイオセーフティキャビネット(BSC)内で作業し、T84細胞をポリエチレンテレフタレート膜細胞培養トランスウェルインサートに播種し、24ウェルプレート用に3 μmの細孔を作製します。目的の実験条件ごとにトランスウェルインサートの反復に加えて、感染していないコントロールを含めて、汚染の可能性を監視します。
- トランスウェルインサートを保持するように設計された24ウェルプレートに、必要な数の収集ウェルに1 mLのTCM +抗生物質を充填します。
- 各ウェルに、1つのトランスウェルインサートを配置します。
- これらのインサートに、500 μLのTCM +抗生物質に懸濁した1 x 105 T84細胞をシードします。トリパンブルー染色を有する血球計算盤または自動セルカウンター17を用いて細胞数を定量化する。
- シードインサートを含むトランスウェルプレートを、細胞が増殖したのと同じ条件でインキュベートします。
- インサートの播種後、播種後約48時間で単層がコンフルエントになり始めたことを光学顕微鏡で確認します。
- 播種後2日ごとに、上皮ボルト/オームメーター(EVOM)を使用して経上皮電気抵抗(TEER)を測定および記録し、単層の成熟度を評価します。インサートが少なくとも1,000 Ω・cm2のTEERに達すると、アッセイ18の準備ができていると見なされます。
注:インサートは通常、播種後このTEERに到達するまでに7〜10日かかります。T84細胞は、この抵抗に達すると、光学顕微鏡下で100%のコンフルエントを示します。- EVOMプローブは、使用しないときは電極を0.15 M KClに浸して保管してください。
- TEERを測定する前に、電極プローブを5mLのコニカルチューブに50mLの70%エタノールに10〜15分間沈めて除染します。プローブを取り外し、余分なエタノールを振り落とし、BSC内で10分間風乾させます。エタノールのチューブを保持します。
- 乾燥した除染プローブを1 mLのTCM +抗生物質を含む滅菌ウェルに入れ、内部に500 μLのTCM +抗生物質を含む滅菌インサートを入れて、EVOMとプローブをテストします。EVOMの読み取り値が<200 Ωであることを確認します。この空白値を記録して、手順1.3.6で説明する後の抵抗計算で使用します。
- TCM +抗生物質のチューブからプローブを取り外します。実験中ずっとプローブを保管するために、このチューブを保持してください。
- プローブを最初のインサートにゆっくりと下げ、長い電極を収集ウェルに、短い電極をインサート内に入れます。長い電極が収集ウェルの底に触れるのを待ちますが、上皮単層を破壊する可能性があるため、押し下げないでください。
- このプロセスを繰り返して、すべてのインサートの抵抗をオーム(Ω)で測定および記録します。終了したら、プローブをさらに10〜15分間沈めてエタノールに除染します。次に、除染されたプローブをKCl溶液に戻して保管します。T84セルを含む各インサートから得られた各値から、ステップ1.3.3で得られたブランク抵抗を差し引きます。各インサートで得られた抵抗(Ω)に各インサートの底部の面積(cm2)を掛けて、最終的なTEER測定値(Ω・cm2)を求めます。
- TEERが少なくとも1,000 Ω·cm2に達すると、上皮単層は成熟し、感染アッセイの準備が整います。
- TEERが成熟したら、1〜2日ごとに細胞に新しい培地を供給します。
- 新しい24ウェルプレートで、調製するシードインサートごとに1 mLのTCM +抗生物質を1ウェルに追加します。
- 滅菌鉗子を使用して、インサートを新しく補充したウェルに慎重に移します。
- メディアをドライブに挿入します。
- プレートを傾け、社内の真空アスピレーターを使用して、インサートの側面に沿ってピペットチップでメディアを静かに取り除き、インサートから古いメディアを取り除きます。吸引器は、細胞の破壊を防ぐために低レベルの吸引の調整を可能にします。ピペットチップがインサートの底部に触れないようにしてください, これは発達中の上皮単層を破壊するからです.
- 500 μLのTCM +抗生物質をインサートに加えます。単層を光学顕微鏡で視覚化し、無傷のままであることを確認します。
- 1〜2日ごとに、上記の手順1.3.2〜1.3.6で説明したように、各インサート全体のTEERを測定します。
2.抗生物質なしでTCMを使用した実験の1日前にT84細胞を準備する
- 実験の前日にTEERを測定して記録します。
- 以前のセルの準備とメンテナンス時と同じ方法でTCMを交換してください。ただし、感染の準備として抗生物質を含まないTCMが代わりに使用されます(プレートウェルに1 mL、インサートに500 μL)。
3. 大腸菌 培養(実験1日前に開始)
注意: 病原性臨床 大腸菌 株を扱うときは、バイオセーフティレベル2(BSL-2)の予防措置を使用してください。
- 5 mLの滅菌溶解ブロス(LB)を含む標識された15 mLコニカルチューブを取り、滅菌ループを使用して、1つの細菌株(大腸菌)からの1つのコロニーをブロスに接種します。このプロセスを繰り返し、試験する菌株ごとに1つの一晩培養チューブを作成します。
- チューブのキャップを緩めた状態で、インキュベーターシェーカー(250rpm、37°C)で一晩培養インキュベートします。
4. 大腸菌 の接種材料、上皮細胞、材料の準備(実験当日)
注:この時点から37°Cまで温めた抗生物質なしでTCMを使用してください。
- 各一晩LB培養から250 μLを、50 mLコニカルチューブ内の抗生物質なしのTCM25 mLに追加します(個々の株ごとに1つ)。チューブのキャップを緩めたままにします。これらの新しい培養チューブをシェーカーに同じ設定(250 rpm、37 °C)で正確に2時間置きます。待機中に残りのサブステップを実行します。
- 手順1.3.2〜1.3.6で説明されているように、各インサート全体のTEERを測定します。これらを時間(t)= 0時間のTEERとして記録します。
- インサートを新しいプレートのウェルに移動し、ステップ 1.4.3 で説明されている手法を使用してメディアを交換します。ただし、今回は、新しい収集ウェルに抗生物質なしのTCMを500 μL、インサートに抗生物質なしのTCMを400 μL充填します。感染時までインサートを組織培養インキュベーター内に保管してください。
- 室温(RT)まで温めるのに十分な数の正方形LB寒天プレートをセットして、後でメッキと細菌の定量を行います。
5.細胞の接種(実験開始)
- 正確に2時間後、朝の細菌培養物をシェーカーから取り出し、10分間遠心分離します(1,900 x g、4°C)。
注意: 以下のすべての手順では、成長を最小限に抑えるために、すべての細菌懸濁液を氷上に置いてください。 - 抗生物質なしでTCMに細菌ペレットを再懸濁します。分光光度計を使用して光学濃度(OD)を0.7〜0.9に調整し、抗生物質なしのTCMでさらに1 x 106 コロニー形成単位(CFU)/ mL(約1:100希釈)の濃度に希釈します。この細菌懸濁液を使用して、各インサートに100 μLの容量あたり1 x 105 CFUを感染させます。
- トランスウェルプレートにラベルを付け、各インサートに100 μLのOD調整接種材料を感染させます(インサートあたり合計1 x 105 CFU)。アッセイが開始されました。時刻をメモし、t = 0 hとして記録します。
- 接種菌懸濁液をプレートし、トラック希釈法を用いてCFU/mLを定量し、10 μLアリコートを正方形LB寒天プレート19にプレーティングする。
6. トランスサイトーシスの定量化
- 接種後30分ごとに、抗生物質を含まない500 μLのTCMを新しいウェルに充填します。異なる細菌株ごとに異なる滅菌鉗子のセットを使用して、これらの新しいウェルにインサートを移します。
- 各インサートの使用済み収集ウェルから培地を別々のラベル付きチューブに回収します。これらのチューブを氷の上に置きます。トランスウェルプレートを時間ポイントの間にインキュベーターに戻します。
- 各インサートについて、t = 0.5時間、t = 1時間、t = 1.5時間、およびt = 2時間から収集した培地を結合し、短時間渦流します。トラック希釈法を用いて採取した培地をLB寒天プレート上にプレートし、実験の最初の2時間にトランスサイトーゼーションされた細菌の量を定量化した。
注:30分ごとに細菌を回収し、氷上に保つことで、収集ウェルでの細菌の増殖を最小限に抑え、主にトランスサイトーゼーションされた細菌で測定を行うことができます。 - 標識トラック希釈LB寒天プレートをCO2補給なしで37°Cの細菌インキュベーターに入れ、T84トランスウェルプレートを組織培養インキュベーターに戻します。
- t = 4時間で、t = 2.5時間、t = 3時間、t = 3.5時間、およびt = 4時間から収集された培地を組み合わせて、ステップ6.3を繰り返します。
- t = 6時間で、t = 4.5時間、t = 5時間、t = 5.5時間、およびt = 6時間から収集された培地を組み合わせて、ステップ6.3を繰り返します。さらに、t = 6時間で、コントロールウェルから培地をプレートします。
7.実験の終了
- 実験終了時、t = 6時間にTEERを測定して記録する。手順 1.3.2-1.3.6 で説明されている手順を使用します。
- プローブを70%エタノールに10〜15分間沈めて除染します。必要に応じて、インサートを破棄するか、追加のアプリケーションのために保存/処理します。LB寒天プレートを一晩インキュベートし、他のすべての使用済み材料を消毒および/または安全に廃棄します。
- 一晩インキュベートした後、トラック希釈LBプレート上で細菌コロニーを手動でカウントし、接種量および 大腸菌 トランスサイトーシスの量を決定した。コントロールプレートに細菌の増殖が見られないことを確認してください。
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Representative Results
図1:T84は時間の経過とともに変化します。 T84セル層がインサート上で成熟するにつれて、単層の電気抵抗が増加します。少なくとも1,000 Ω・cm2のTEERでは、細胞層は、傍細胞細菌輸送を減少させ、主に経細胞細菌輸送の測定を可能にするのに十分に発達している。エラーバーは標準偏差を示します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
セクション1で説明した無菌T84細胞の増殖中、T84単層全体のTEERは時間とともに継続的に上昇し、播種から約7日後に1,000 Ω・cm2 を超えます( 図1を参照)。上皮細胞の分極とTEERの成熟は、Caco-2などの他の腸細胞よりもT84細胞の方が堅牢ですが、それでもいくつかのトラブルシューティングが必要になる場合があります6。インサートのTEERは、測定間で劇的に低下してはなりません。TEERのこのような低下は、上皮単層の機械的破壊を示している可能性があります。培地交換中は、アスピレーターの先端が細胞培養インサートの底部に触れないようにする必要があります。この種の損傷が疑われる場合は、吸引場所の近くに上皮細胞がないことを光学顕微鏡で視覚化することができます。取り扱いによる損傷に加えて、TEERの減少は汚染を示している可能性があります。
図2:新生児大腸菌分離株の経時的トランスサイトーシス。T84インサートを感染させた後、捕集井に到達することに成功した新生児大腸菌臨床分離株は、トラック希釈法を使用して定量されます。異なる大腸菌株は、腸上皮をトランスサイトーゼする能力の観点から比較することができる。非病原性大腸菌DH5アルファを比較対象として含めた。プロットには、各時点での平均CFUと標準誤差が表示されます。平均トランスサイトーシス値の比較は片側t検定で行われ、感染後2時間(*p<0.05)、4時間(**p < 0.04)、および6時間(***p < 0.04)で新生児大腸菌分離株#1と#2の間に有意差が示されました。対照的に、非病原性大腸菌株DH5アルファは、第3のプロットに示すように、最小限のトランスサイトーシスを受けた。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
定量化されたトランスサイトーシスは、 図2に示すように表すことができます。この例では、実験は、それぞれが2つの異なる新生児浸潤性 大腸菌 分離株に感染した3つのインサートを用いて実施した。非病原性株であるDH5アルファも比較のためにテストされました。2つの滅菌対照インサートも含まれていました(細菌が分離されていないため、プロットは表示されません)。この手順からのデータは、腸上皮をトランスサイトーゼする単一の 大腸菌 株の能力を説明するのに役立ちます。データはまた、異なる株のトランスサイトーシス能力の比較を可能にするかもしれない(さらなるアプリケーションについては議論のセクションを参照されたい)。
図3:感染直前と感染後6時間。インサートのTEERは、通常、新生児大腸菌血症産生株2に感染した後に増加します。感染したインサートは、感染していないコントロールインサートよりもTEERの増加が大きいことを示しています。TEERは、t検定で計算されたように、新生児大腸菌株#1(*p < 0.01)および大腸菌株#2(**p < 0.03)に6時間感染した後、T84単層で有意に高かった。非感染対照T84単層のTEERも増加したが、感染前値と感染後値の差は統計学的に有意ではなかった。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3 は、腸上皮細胞をトランスサイトースする能力が異なる2つの新生児 大腸菌 臨床分離株による感染前後の典型的なTEER結果を示しています。トランスサイトーシスの速度と量は 、図2に示すように株によって異なりますが、TEERは両方の病原性株に感染した後に有意に増加します。
この実験では、汚染の存在下で結果が変更される可能性があります。使用した新生児 大腸菌 株は、TEERの減少を引き起こすほど上皮単層に十分な損傷を与えませんでしたが、細菌はトランスサイトーゼすることができました。汚染物質が存在する場合、腸細胞に損傷を与え、その後TEERを低下させる可能性があります。滅菌制御インサートは、そのような汚染の可能性を特定するのに役立ちます。この手順で使用される組織培養培地には、フェノールレッドpH指示薬が含まれています。一般に、培地は、無菌であるか、または小さな接種材料に感染している場合、透明なピンク色に見えます。著しい成長または汚染により、培地は濁り、黄色、または悪臭に変わる可能性があります。感染前は、すべてのT84インサートのメディアは通常、透明なピンク色に見えます。
一晩インキュベーションした後、汚染をチェックする最後の場所はLB寒天プレート上です。コントロールプレートは成長を示さないはずです。 大腸菌に感染したインサートの収集ウェルから作られたプレートには、均質で丸い黄色 の大腸菌 コロニーが含まれている必要があります。汚染のリスクを最小限に抑えるために、すべての作業はバイオセーフティキャビネットで実行する必要があります。滅菌組織培養、 大腸菌感染組織培養、および細菌操作には、別々のキャビネットとインキュベーターを使用する必要があります。作業スペースは清潔に保ち、全体を通して滅菌技術を使用する必要があります。
図4:トランスウェルシステムと関連する腸細胞構造の図式図。 (A)トランスウェルインサートの断面図(青);インサートの下部にある縦線は、透過性の細孔を示しています。分極した腸上皮細胞は、インサートの下部に単層を形成します。組織培養培地はピンク色で示され、2本爪のEVOMプローブがその中に浸されています。反対側のプローブワイヤは、EVOM装置(図示せず)に引っ掛けられている。(b)腸管上皮細胞のタイトジャンクション成分の簡略図。縦矢印は、分極した腸上皮単層の頂端から基底外側への細菌通過の可能な経路を表す。略語:ZO =帯閉塞タンパク質;JAM =接合接着分子。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
補足図1:新生児 大腸菌 分離株の経時的な頂端増殖。 トランスウェルインサート内のT84細胞を覆う上清中の 大腸菌 の測定は、任意の追加エンドポイントとして実行できます。この図は、トランスサイトーシスについて試験された両方の病原性大腸菌 株の頂端増殖が経時的に有意差がなかったことを示しています。エラーバーは標準偏差を示します。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
この方法は、消化器病学および感染症20で使用される技術に由来します。腸管上皮バリアのin vitroモデルは、管腔内容物が自然免疫のこの関連成分と相互作用するメカニズムを解明するために使用されています6,8。侵襲性新生児大腸菌の宿主と病原体の相互作用も、遺伝子分析、抗菌薬耐性の研究、および免疫学的手法を通じて個別に特徴付けられています1,5,16,21。しかし、大腸菌新生児分離株が腸から血流に入る能力を支える分子メカニズムについてはほとんど知られていません3。
本明細書で実証されるトランスサイトーシス技術は、経腸獲得後に敗血症を生じる新生児 大腸菌 侵襲株のより詳細な特徴付けを可能にする。新生児菌血症は多段階のプロセスであり、トランスサイトーシスは関連するステップの1つです。浸潤モデルと比較して、このトランスサイトーシス法は、菌血症の病因に関与するメカニズムに関する追加情報を提供します。場合によっては、病原性 大腸菌 は血流に到達せずに小腸に侵入し、感染を限局性疾患を引き起こすことに限定します22。したがって、単に腸上皮に侵入する細菌の能力は、上皮バリアを完全に通過する能力を反映していない可能性があります。このモデルは、特に電子顕微鏡法などの追加の技術が組み込まれている場合、経細胞または傍細胞経路を通る腸上皮を横切る細菌の通過過程を研究するために利用することができる20。in vivo 動物モデルと比較して、この in vitro モデルはより効率的であり、いくつかの潜在的な変数のより良い制御を可能にします。さらに、 in vivo 実験の代替手段を提供することにより、動物福祉に貢献します。
これらの利点にもかかわらず、この実験にはまだ限界があります。一つには、このアッセイは、インキュベーション中の上皮の頂端側の細菌増殖の違いを考慮していません。このような増殖の違いは、各株のトランスサイトーシスの量に影響を与える可能性があります。ユーザーは、このモデルで得られた結果のより包括的な特性評価のために、頂端の成長を測定することを選択できます。この原稿で提示された方法におけるトランスサイトーシス実験に使用された2つの大腸菌分離株の頂端増殖の例を補足図1に示します。さらに、このモデルは腸上皮単層を合理的に再現しますが、摂取された病原体から血流を保護する腸バリアのすべての成分を完全に表しているわけではありません。それにもかかわらず、腸上皮のいくつかの特性はこのモデルで研究することができます。例えば、T84細胞は塩化物を分泌し、ムチン23を産生する。下痢を産生する大腸菌による浸潤は、T84細胞における塩化物分泌の増加および感染後6時間を超えるTEERの有意な減少と関連している24。このモデルでは、菌血症産生大腸菌株による侵入も塩化物分泌を増加させ、感染の6時間後にTEERの減少が起こる可能性があります。このモデルは、他の研究者が望む場合、イオン輸送と細菌侵入の関係に関する研究に適合させることができます。ムチンは病原体から上皮を保護する物理的な障壁です。他の大腸菌株による感染は、T84細胞によるムチン発現を減少させる25。腸上皮を横切る新生児大腸菌トランスサイトーシスの病因におけるムチンの役割も、このモデルで研究することができます。このモデルの別の用途は、細菌のシクロモジュリンの細胞毒性効果と、新生児大腸菌株のトランスサイトーシスの過程におけるそれらの可能な役割を研究することです。例えば、いくつかの病原性大腸菌株によって産生される細胞傷害性壊死因子-1(CNF-1)は、感染した真核細胞のタイトジャンクション機能とアポトーシスの調節に重要なRhoGTPアーゼを標的としています26。このトランスウェルモデルは、これらの細胞毒素が腸上皮27に影響を及ぼすメカニズムをよりよく理解するために適合させることができる。このモデルを利用して新生児大腸菌株と腸上皮との相互作用を研究する場合、腸上皮のモデル化に使用されるT84細胞は、成人の結腸腺癌の肺転移に由来することを考慮することが重要です6。T84細胞での研究では、ヒトの新生児および新生児動物の腸細胞で同様の効果に変換された腸透過性に対する特定の効果が再現されていますが28,29、胎児と新生児の腸管上皮は、侵襲性大腸菌の存在下で異なる動作をする可能性があります。
このモデルとそれが提供するデータの品質を最適化するために、いくつかのトラブルシューティングが必要になる場合があります。滅菌制御インサートの使用については、代表的な結果のセクションで詳しく説明します。他の非侵襲的 大腸菌 株も、陰性/最小経細胞症対照として含めることができます。さらに、Caco-2などの異なる細胞株を使用して、トランスサイトース分極腸上皮に対する新生児 大腸菌 株の能力を評価することができます。 大腸菌 の浸潤およびトランスサイトーシスは、Caco-2細胞30と比較してT84細胞の方が大きいことが見出されている。したがって、このモデルを利用して、分極してタイトジャンクションを形成するこれらの上皮細胞および他の上皮細胞との細菌性トランスサイトーシスを評価する場合は、これらの違いを考慮する必要があります。個々のトランスウェルインサートのTEER測定には数秒かかり、複数の菌株をテストする場合は、追加のオペレーター時間を考慮する必要があります。トランスウェルシステムにおけるTEERのより効率的なモニタリング方法が開発され続けています。これらの新しいデバイスは、複数のトランスウェルインサートで同時にリアルタイムでTEERを監視することを可能にします31。これらのオプションを検討している研究者は、節約された時間が、本明細書に記載されている単一電極測定と比較して、これらの新しいデバイスの価格の上昇を相殺できる可能性があるかどうかを判断する必要があります。
いくつかの課題が考えられますが、このアッセイにより、研究者はトランスサイトーシスの量だけでなく、 大腸菌 血症の病因に関与する特定のメカニズムを研究することができます。分子微生物学技術と組み合わせると、このプロセスは、動物モデルで試みられているように、 大腸菌 が腸上皮をトランスサイトーゼする能力に対する個々の遺伝子の影響を特定するために使用できます32。このモデルは、免疫細胞の共培養またはサイトカイン、成長因子、および薬学的介入の添加によっても改変して、より複雑な免疫および薬力学的応答をシミュレートすることができる33。
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Disclosures
何一つ。
Acknowledgments
この研究は、ミズーリ大学カンザスシティ医学部がAIに発行したサラモリソン学生助成金によってサポートされました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10,000 U/ mL Penicillin/Streptomycin Mixture | Fisher Scientific | 15-140-122 | |
| 15 mL sterile conical tubes | MidSci | C15B | |
| 2 mL microcentrifuge tubes | Avant | AVSS2000 | |
| 50 mL sterile polypropylene conical tubes | Falcon | 352070 | |
| Aspirator | Corning | 4930 | |
| Biosafety Cabinets | Labconco | 30441010028343 | Three of these are used in the method: one for sterile tissue work, one for infected tissue work, and one for bacterial work. |
| Centrifuge | Sorvall | Legend RT | |
| Disposable inoculation loops | Fisherbrand | 22363605 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11965-084 | |
| Epithelial Volt/Ohm Meter | World Precision Instruments | EVOM2 | |
| Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | 10437028 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mixture | Gibco | 11765-047 | |
| Hemacytometer | Sigma Aldrich, Bright Line | Z359629 | |
| Incubator shaker | New Brunswick | Innova 4080 | |
| Incubators | Thermo Scientific | 51030284 | Three of these are used in the method: one for sterile tissue culturing, one for infected tissue culturing, and one for bacterial incubation. |
| Lysogeny broth | Difco | 244610 | |
| Lysogeny broth agar | IBI Scientific | IB49101 | |
| Nikon Eclipse TS2R Microscope | Nikon | ||
| Spectrophotometer | Unico | 1100RS | |
| T84 Intestinal Cells | American Tissue Culture Collection | CCL248 | |
| Tissue culture inserts, with polyethylene trephthalate membrane, 3 µm pores, 24 well format | Falcon | 353096 | |
| Tissue culture plate, 24 wells | Falcon | 353504 | |
| Trypan blue stain | Fisher Scientific | T10282 |
References
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