Primaire cultuur van porcine retinale pigmentepitheelcellen
Summary
Hier wordt een eenvoudig te volgen methode gepresenteerd om primaire retinale pigmentepitheelcellen van varkens in vitro te kweken.
Abstract
Het retinale pigmentepitheel (RPE) is een monolaag van gepolariseerde gepigmenteerde epitheelcellen, gelegen tussen het vaatvlies en neuroretina in het netvlies. Meerdere functies, waaronder fagocytose, transport van voedingsstoffen / metabolieten, vitamine A-metabolisme, enz., Worden dagelijks door de RPE uitgevoerd. RPE-cellen zijn terminaal gedifferentieerde epitheelcellen met weinig of geen regeneratief vermogen. Verlies van RPE-cellen resulteert in meerdere oogziekten die leiden tot visuele beperkingen, zoals leeftijdsgebonden maculaire degeneratie. Daarom is de vaststelling van een in vitro kweekmodel van primaire RPE-cellen, dat meer lijkt op de RPE in vivo dan cellijnen, van cruciaal belang voor de karakteristieke en mechanistische studies van RPE-cellen. Gezien het feit dat de bron van menselijke oogbollen beperkt is, maken we een protocol om primaire varkens RPE-cellen te kweken. Door dit protocol te gebruiken, kunnen RPE-cellen gemakkelijk worden gedissocieerd van volwassen varkensoogbollen. Vervolgens hechten deze gedissocieerde cellen zich aan kweekschalen / inserts, prolifereren zich om een confluente monolaag te vormen en herstellen snel de belangrijkste kenmerken van epitheelweefsel in vivo binnen 2 weken. Door qRT-PCR wordt aangetoond dat RPE-cellen van primaire varkens meerdere signatuurgenen tot expressie brengen op vergelijkbare niveaus met inheems RPE-weefsel, terwijl de expressies van de meeste van deze genen verloren gaan / sterk verminderd zijn in menselijke RPE-achtige cellen, ARPE-19. Bovendien toont de immunofluorescentiekleuring de verdeling van tight junction, weefselpolariteit en cytoskeleteiwitten, evenals de aanwezigheid van RPE65, een isomerase dat cruciaal is voor het vitamine A-metabolisme, in gekweekte primaire cellen. Al met al hebben we een eenvoudig te volgen benadering ontwikkeld om primaire varkens RPE-cellen te kweken met een hoge zuiverheid en native RPE-kenmerken, die zou kunnen dienen als een goed model om RPE-fysiologie te begrijpen, celtoxiciteiten te bestuderen en medicijnscreenings te vergemakkelijken.
Introduction
Het retinale pigmentepitheel (RPE) bevindt zich tussen fotoreceptoren en choriocapillaris in de buitenste laag van het netvlies1 met meerdere functies, waaronder het vormen van de bloed-retinale barrière, het transporteren en uitwisselen van voedingsstoffen en retinale metabolieten, het recyclen van vitamine A om een normale visuele cyclus te behouden, en fagocytose en klaring van afgeworpen fotoreceptor buitenste segmenten (POSs)2,3 . Omdat POS’en constante zelfvernieuwing vereisen om visie te genereren, moeten de RPE-cellen continu losgemaakte POS’en overspoelen om retinale homeostase te behouden4. Daarom resulteert RPE-disfunctie in veel verblindende oogziekten, zoals leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (AMD)4, retinitis pigmentosa (RP)5, Leber congenitale amaurosis6, diabetische retinopathie7, enz. Tot nu toe blijft de exacte pathogenese van de meeste van deze ziekten ongrijpbaar. Als gevolg hiervan wordt RPE-celcultuur opgericht om RPE-celbiologie, pathologische veranderingen en onderliggende mechanismen te bestuderen.
Als het eenvoudigste model om celbiologie te bestuderen, werd de kweek van RPE-cellen al in de jaren 1920 gestart8. Hoewel ARPE-19 veel wordt gebruikt als RPE-cellen, roepen verlies van pigmentatie, kasseimorfologie en vooral de barrièrefuncties in deze cellijn veel zorgen op9. Ter vergelijking: de kweek van primaire menselijke RPE-cellen biedt een realistischer scenario voor fysiologische en pathologische studies9. De relatief beperkte beschikbaarheid beperkt echter het gebruik ervan en ethische kwesties bestaan altijd. Daarnaast gebruikten verschillende groepen muismodellen om RPE-cellen te kweken. De grootte van het muizenoog is echter klein en een enkele cultuur vereist meestal veel muizen, wat niet handig is9. Onlangs hebben wetenschappers nieuwe methoden ontwikkeld om menselijke embryonale stamcellen of geïnduceerde pluripotente stamcellen te gebruiken om RPE-cellen af te leiden. Hoewel deze techniek een bijzonder potentieel heeft voor de behandeling van erfelijke RPE-aandoeningen, is het tijdrovend en duurt het meestal enkele maanden om volwassen RPE-cellen te genereren10. Om deze problemen te overwinnen, introduceren we hier een eenvoudig te volgen protocol om RPE-cellen met een hoge zuiverheidsgraad routinematig in het laboratorium te isoleren en te kweken. Onder geschikte kweekomstandigheden kunnen deze cellen typische RPE-functies weergeven en typische RPE-morfologieën vertonen. Daarom kan deze kweekmethode een goed model bieden om de RPE-fysiologie te begrijpen, cytotoxiciteit te bestuderen, pathologische mechanismen van gerelateerde oogziekten te onderzoeken en medicijnscreenings uit te voeren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier is een gedetailleerd en geoptimaliseerd protocol beschreven voor de isolatie, kweek en karakterisering van RPE-cellen uit varkensoogbollen, dat een goed model genereert voor in vitro karakterisering van RPE-cellen en RPE-gerelateerde stoornisstudies. Methoden voor de isolatie van de RPE van menselijke, muis- en rattenogen zijn eerder beschreven 23,24,25. Het is echter moeilijk om menselijke oogbollen te verkrijgen …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen graag hun dankbaarheid en respect tonen voor alle dieren die hun cellen bijdragen aan deze studie. Deze studie werd gedeeltelijk ondersteund door subsidies van het National Key R &D-programma van China (2019YFA0111200, Yi Liao & Yuan Gao en Grant nos. 2018YFA0107301, Wei Li). De auteurs bedanken Jingru Huang en Xiang You van Central Lab, School of Medicine, Xiamen University voor technische ondersteuning bij confocale beeldvorming.
Materials
| ARPE-19 cells | CCTCC | GDC0323 | |
| Bovine serum albumin | Yeasen | 36101ES60 | |
| Confocal microscopy | Zeiss | LSM 880 with Airyscan | |
| ChemiDoc Touch | Bio-Rad | 1708370 | |
| Cell scraper | Sangon | F619301 | |
| 10 cm culture dish | NEST | 121621EH01 | |
| 12-well culture plate | NEST | 29821075P | |
| DMEM F12 Medium | Gibco | C11330500BT | |
| DMEM basic Medium | Gibco | C11995500BT | |
| EVOM2 | World Precision Instruments | EVOM2 | For TER measurement |
| Fetal bovine serum | ExCell Bio | FSP500 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11034 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A-11012 | |
| Goat anti Mouse IgG (H/L):HRP | Bio-Rad | 0300-0108P | |
| Goat anti Rabbit IgG (H/L):HRP | Bio-Rad | 5196-2504 | |
| hydrocortisone | MCE | HY-N0583/CS-2226 | |
| Hoechst 33342 solution (20 mM) | ThermoFisher Scientific | 62249 | |
| LightCycler 96 Instrument | Roche | 5815916001 | |
| Liothyronine | MCE | HY-A0070A/CS-4141 | |
| laminin | Sigma-Aldrich | L2020-1MG | |
| MEM(1X)+GlutaMAX Medium | Gibco | 10566-016 | |
| MEM NEAA(100X) | Gibco | 11140-050 | |
| Millex-GP syringe filter unit | Millipore | SLGPR33RB | |
| N1 | Sigma-Aldrich | SLCF4683 | |
| NcmECL Ultra | New Cell&Molecular Biotech | P10300 | |
| Non-fat Powdered Milk | Solarbio | D8340 | |
| Nicotinamide | SparkJade | SJ-MV0061 | |
| Na+-K+ ATPase antibody | Abcam | ab76020 | Recognize both human and porcine proteins |
| PAGE Gel Fast Preparation Kit(10%) | Epizyme | PG112 | |
| primary Human RPE cells | – | – | Generous gift from Shoubi Wang lab |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| Prism | GraphPad by Dotmatics | version 8.0 | |
| Protease Inhibitor Cocktails | APExBIO | K1024 | |
| PRE65 antibody | Proteintech | 17939-1-AP | Recognize both human and porcine proteins |
| PEDF antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-390172 | Recognize both human and porcine proteins |
| 100 x penicillin/streptomycin | Biological Industries | 03-031-1BCS | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | RARBIO | RA-9005 | |
| ReverTra Ace qPCR RT Master Mix | Toyobo | FSQ-201 | |
| RIPA buffer | ThermoFisher Scientific | 89900 | |
| 15 mL sterile centrifuge tubes | NEST | 601052 | |
| 50 mL sterile centrifuge tubes | NEST | 602052 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| Taurine | Damas-beta | 107-35-7 | |
| Trizol | Thermo-Fisher | 15596026 | RNA extraction solution |
| TB Green Fast qPCR Mix | Takara | RR430A | |
| 12-well transwell inserts | Labselect | 14212 | |
| VEGF antibody | Proteintech | 19003-1-AP | Recognize both human and porcine proteins |
| VEGF ELISA kit | Novusbio | VAL106 | |
| ZO-1 antibody | ABclonal | A0659 | Recognize both human and porcine proteins |
References
- Tan, L. X., Germer, C. J., La Cunza, N., Lakkaraju, A. Complement activation, lipid metabolism, and mitochondrial injury: Converging pathways in age-related macular degeneration. Redox Biology. 37, 101781 (2020).
- Caceres, P. S., Rodriguez-Boulan, E. Retinal pigment epithelium polarity in health and blinding diseases. Current Opinion in Cell Biology. 62, 37-45 (2020).
- Lakkaraju, A., et al. The cell biology of the retinal pigment epithelium. Progress in Retinal and Eye Research. 78, 100846 (2020).
- Somasundaran, S., Constable, I. J., Mellough, C. B., Carvalho, L. S. Retinal pigment epithelium and age-related macular degeneration: A review of major disease mechanisms. Clinical & Experimental Ophthalmology. 48 (8), 1043-1056 (2020).
- Ducloyer, J. B., Le Meur, G., Cronin, T., Adjali, O., Weber, M. Gene therapy for retinitis pigmentosa. Medecine Sciences. 36 (6-7), 607-615 (2020).
- den Hollander, A. I., Roepman, R., Koenekoop, R. K., Cremers, F. P. Leber congenital amaurosis: genes, proteins and disease mechanisms. Progress in Retinal and Eye Research. 27 (4), 391-419 (2008).
- Samuels, I. S., Bell, B. A., Pereira, A., Saxon, J., Peachey, N. S. Early retinal pigment epithelium dysfunction is concomitant with hyperglycemia in mouse models of type 1 and type 2 diabetes. Journal of Neurophysiology. 113 (4), 1085-1099 (2015).
- Smith, D. T. Melanin pigment in the pigmented epithelium of the retina of the embryo chick eye studied in vivo and in vino. The Anatomical Record. 18, 260-261 (1920).
- Schnichels, S., et al. Retina in a dish: Cell cultures, retinal explants and animal models for common diseases of the retina. Progress in Retinal and Eye Research. 81, 100880 (2021).
- D’Antonio-Chronowska, A., D’Antonio, M., Frazer, K. A. In vitro differentiation of human iPSC-derived retinal pigment epithelium cells (iPSC-RPE). Bio-Protocol. 9 (24), 3469 (2019).
- Hazim, R. A., Volland, S., Yen, A., Burgess, B. L., Williams, D. S. Rapid differentiation of the human RPE cell line, ARPE-19, induced by nicotinamide. Experimental Eye Research. 179, 18-24 (2019).
- Dunn, K. C., Aotaki-Keen, A. E., Putkey, F. R., Hjelmeland, L. M. ARPE-19, a human retinal pigment epithelial cell line with differentiated properties. Experimental Eye Research. 62 (2), 155-169 (1996).
- . Scientific, T Available from: https://www.thermofisher.cn/document-connect/document (2022)
- . Toyota Available from: https://www.toyoboglobal.com/seihin/xr/likescience/support/manual/FSQ-201.pdf (2022)
- . Abcam Available from: https://www.abcam.cn/protocols/immunocytochemistry-immunofluorescence-protocol (2022)
- . Zeiss Available from: https://www.zeiss.com/microscopy/en/products/software/zeiss-zen-lite.html#manuals (2022)
- . Cell Signal Technology Available from: https://www.cellsignal.cn/learn-and-support/protocols/protocol-western (2022)
- Wang, S., et al. Reversed senescence of retinal pigment epithelial cell by coculture with embryonic stem cell via the TGFbeta and PI3K pathways. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 588050 (2020).
- Pfeffer, B. A., Philp, N. J. Cell culture of retinal pigment epithelium: Special Issue. Experimental Eye Research. 126, 1-4 (2014).
- Lehmann, G. L., Benedicto, I., Philp, N. J., Rodriguez-Boulan, E. Plasma membrane protein polarity and trafficking in RPE cells: past, present and future. Experimental Eye Research. 126, 5-15 (2014).
- Anderson, J. M., Van Itallie, C. M. Physiology and function of the tight junction. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (2), 002584 (2009).
- Nita, M., Strzalka-Mrozik, B., Grzybowski, A., Mazurek, U., Romaniuk, W. Age-related macular degeneration and changes in the extracellular matrix. Medical Science Monitor. 20, 1003-1016 (2014).
- Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells. Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).
- Langenfeld, A., Julien, S., Schraermeyer, U. An improved method for the isolation and culture of retinal pigment epithelial cells from adult rats. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 253 (9), 1493-1502 (2015).
- Sonoda, S. A protocol for the culture and differentiation of highly polarized human retinal pigment epithelial cells. Nature Protocols. 4 (5), 662-673 (2009).
