Culture primaire de cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes porcines

Summary

Ici, une méthode facile à suivre pour cultiver in vitro des cellules épithéliales pigmentaires primaires de la rétine porcine est présentée.

Abstract

L’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) est une monocouche de cellules épithéliales pigmentées polarisées, située entre la choroïde et la neurorétine dans la rétine. De multiples fonctions, y compris la phagocytose, le transport des nutriments / métabolites, le métabolisme de la vitamine A, etc., sont effectuées quotidiennement par l’EPR. Les cellules EPR sont des cellules épithéliales différenciées en phase terminale avec peu ou pas de capacité de régénération. La perte de cellules EPR entraîne de multiples maladies oculaires entraînant une déficience visuelle, telles que la dégénérescence maculaire liée à l’âge. Par conséquent, l’établissement d’un modèle de culture in vitro de cellules EPR primaires, qui ressemble plus à l’EPR in vivo qu’aux lignées cellulaires, est essentiel pour les études caractéristiques et mécanistes des cellules EPR. Compte tenu du fait que la source des globes oculaires humains est limitée, nous créons un protocole pour cultiver des cellules primaires d’EPR porcines. En utilisant ce protocole, les cellules EPR peuvent être facilement dissociées des globes oculaires porcins adultes. Par la suite, ces cellules dissociées se fixent aux boîtes de culture, prolifèrent pour former une monocouche confluente et rétablissent rapidement les principales caractéristiques du tissu épithélial in vivo en 2 semaines. Par qRT-PCR, il est démontré que les cellules RPE porcines primaires expriment plusieurs gènes de signature à des niveaux comparables avec le tissu RPE natif, tandis que les expressions de la plupart de ces gènes sont perdues / fortement réduites dans les cellules humaines de type EPR, ARPE-19. De plus, la coloration par immunofluorescence montre la distribution de la jonction serrée, de la polarité tissulaire et des protéines du cytosquelette, ainsi que la présence de RPE65, une isomérase essentielle au métabolisme de la vitamine A, dans les cellules primaires en culture. Dans l’ensemble, nous avons développé une approche facile à suivre pour la culture de cellules EPR porcines primaires avec des caractéristiques RPE de haute pureté et natives, qui pourrait servir de bon modèle pour comprendre la physiologie de l’EPR, étudier les toxicités cellulaires et faciliter les dépistages de médicaments.

Introduction

L’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) est situé entre les photorécepteurs et la choriocapillarise dans la couche externe de la rétine¹ avec de multiples fonctions, y compris la formation de la barrière hémato-rétinienne, le transport et l’échange de nutriments et de métabolites rétiniens, le recyclage de la vitamine A pour maintenir un cycle visuel normal, et la phagocytose et la clairance des segments externes des photorécepteurs (POS)^2,3 . Étant donné que les PDV nécessitent un auto-renouvellement constant pour générer la vision, les cellules EPR doivent continuellement engloutir les POS détachés pour maintenir l’homéostasie rétinienne⁴. Par conséquent, le dysfonctionnement de l’EPR entraîne de nombreuses maladies oculaires cécitantes, telles que la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA)⁴, la rétinite pigmentaire (RP)⁵, l’amaurose congénitale de Leber⁶, la rétinopathie diabétique⁷, etc. Jusqu’à présent, la pathogenèse exacte de la plupart de ces maladies reste insaisissable. En conséquence, la culture cellulaire RPE est établie pour étudier la biologie cellulaire RPE, les changements pathologiques et les mécanismes sous-jacents.

En tant que modèle le plus simple pour étudier la biologie cellulaire, la culture de cellules EPR a commencé dès les années 1920⁸. Bien que l’ARPE-19 soit largement utilisé comme cellules EPR, la perte de pigmentation, la morphologie des pavés et, surtout, les fonctions de barrière dans cette lignée cellulaire soulèvent beaucoup de préoccupations⁹. En comparaison, la culture de cellules EPR humaines primaires offre un scénario plus réaliste pour les études physiologiques et pathologiques⁹. Cependant, la disponibilité relativement limitée restreint leur utilisation et des problèmes éthiques existent toujours. En outre, plusieurs groupes ont utilisé des modèles murins pour cultiver des cellules EPR. Cependant, la taille de l’œil de souris est petite et une seule culture nécessite généralement de nombreuses souris, ce qui n’est pas pratique⁹. Récemment, les scientifiques ont mis au point de nouvelles méthodes pour utiliser des cellules souches embryonnaires humaines ou des cellules souches pluripotentes induites pour dériver des cellules EPR. Bien que cette technique ait un potentiel particulier pour le traitement des troubles héréditaires de l’EPR, elle prend beaucoup de temps et nécessite généralement plusieurs mois pour générer des cellules EPR matures¹⁰. Pour surmonter ces problèmes, nous introduisons ici un protocole facile à suivre pour isoler et cultiver régulièrement des cellules EPR de haute pureté en laboratoire. Dans des conditions de culture appropriées, ces cellules peuvent présenter des fonctions RPE typiques et présenter des morphologies RPE typiques. Par conséquent, cette méthode de culture peut fournir un bon modèle pour comprendre la physiologie de l’EPR, étudier la cytotoxicité, étudier les mécanismes pathologiques des maladies oculaires connexes et effectuer des dépistages de médicaments.

Protocol

L’utilisation d’animaux de laboratoire était conforme aux règlements de l’Association pour la recherche en vision et ophtalmologie (ARVO) et a été approuvée par le Comité d’éthique de la gestion des animaux expérimentaux de l’Université de Xiamen. 1. Préparation de dispositifs chirurgicaux expérimentaux, d’enzymes de digestion tissulaire et de tampons de culture cellulaire Préparer les dispositifs chirurgicaux expérimentaux, en nettoyant et e…

Representative Results

Les cellules primaires de l’EPR porcine (EPRP) ont été cultivées dans un milieu DMEM/Basic avec 10 % de FBS, et la morphologie cellulaire au microscope optique a été photographiée 2 jours (figure 2A), 6 jours (figure 2B) et 10 jours (figure 2C) après l’ensemencement. Après 1 semaine, une monocouche confluente de cellules pRPE pigmentées avec des morphologies pavées a été observée. Pour mi…

Discussion

Ici, un protocole détaillé et optimisé pour l’isolement, la culture et la caractérisation des cellules EPR à partir de globes oculaires porcins, qui génère un bon modèle pour la caractérisation in vitro des cellules EPR et les études sur les troubles liés à l’EPR, a été décrit. Des méthodes d’isolement de l’EPR à partir d’yeux humains, de souris et de rats ont été décrites précédemment^23,24,25<…

Materials

ARPE-19 cells	CCTCC	GDC0323
Bovine serum albumin	Yeasen	36101ES60
Confocal microscopy	Zeiss	LSM 880 with Airyscan
ChemiDoc Touch	Bio-Rad	1708370
Cell scraper	Sangon	F619301
10 cm culture dish	NEST	121621EH01
12-well culture plate	NEST	29821075P
DMEM F12 Medium	Gibco	C11330500BT
DMEM basic Medium	Gibco	C11995500BT
EVOM2	World Precision Instruments	EVOM2	For TER measurement
Fetal bovine serum	ExCell Bio	FSP500
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	ThermoFisher Scientific	A-11034
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594	ThermoFisher Scientific	A-11012
Goat anti Mouse IgG (H/L):HRP	Bio-Rad	0300-0108P
Goat anti Rabbit IgG (H/L):HRP	Bio-Rad	5196-2504
hydrocortisone	MCE	HY-N0583/CS-2226
Hoechst 33342 solution (20 mM)	ThermoFisher Scientific	62249
LightCycler 96 Instrument	Roche	5815916001
Liothyronine	MCE	HY-A0070A/CS-4141
laminin	Sigma-Aldrich	L2020-1MG
MEM(1X)+GlutaMAX Medium	Gibco	10566-016
MEM NEAA(100X)	Gibco	11140-050
Millex-GP syringe filter unit	Millipore	SLGPR33RB
N1	Sigma-Aldrich	SLCF4683
NcmECL Ultra	New Cell&Molecular Biotech	P10300
Non-fat Powdered Milk	Solarbio	D8340
Nicotinamide	SparkJade	SJ-MV0061
Na+-K+ ATPase antibody	Abcam	ab76020	Recognize both human and porcine proteins
PAGE Gel Fast Preparation Kit(10%)	Epizyme	PG112
primary Human RPE cells	–	–	Generous gift from Shoubi Wang lab
Pierce BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher Scientific	23225
Prism	GraphPad by Dotmatics	version 8.0
Protease Inhibitor Cocktails	APExBIO	K1024
PRE65 antibody	Proteintech	17939-1-AP	Recognize both human and porcine proteins
PEDF antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-390172	Recognize both human and porcine proteins
100 x penicillin/streptomycin	Biological Industries	03-031-1BCS
Phosphate buffered saline (PBS)	RARBIO	RA-9005
ReverTra Ace qPCR RT Master Mix	Toyobo	FSQ-201
RIPA buffer	ThermoFisher Scientific	89900
15 mL sterile centrifuge tubes	NEST	601052
50 mL sterile centrifuge tubes	NEST	602052
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	25200-056
Taurine	Damas-beta	107-35-7
Trizol	Thermo-Fisher	15596026	RNA extraction solution
TB Green Fast qPCR Mix	Takara	RR430A
12-well transwell inserts	Labselect	14212
VEGF antibody	Proteintech	19003-1-AP	Recognize both human and porcine proteins
VEGF ELISA kit	Novusbio	VAL106
ZO-1 antibody	ABclonal	A0659	Recognize both human and porcine proteins