पोर्सिन रेटिना पिगमेंट एपिथेलियल कोशिकाओं की प्राथमिक संस्कृति
Summary
यहां, विट्रो में प्राथमिक पोर्सिन रेटिना वर्णक उपकला कोशिकाओं को कल्चर करने के लिए एक आसान-से-पालन विधि प्रस्तुत की गई है।
Abstract
रेटिना वर्णक उपकला (आरपीई) ध्रुवीकृत रंजित उपकला कोशिकाओं का एक मोनोलेयर है, जो रेटिना में कोरॉयड और न्यूरोरेटिना के बीच स्थित है। मेटाबोलाइट परिवहन, विटामिन ए चयापचय, आदि सहित कई कार्य, आरपीई द्वारा दैनिक आधार पर आयोजित किए जाते हैं। आरपीई कोशिकाएं बहुत कम या कोई पुनर्योजी क्षमता के साथ टर्मिनल रूप से विभेदित उपकला कोशिकाएं हैं। आरपीई कोशिकाओं के नुकसान के परिणामस्वरूप कई आंखों की बीमारियां होती हैं, जिससे दृष्टि हानि होती है, जैसे कि उम्र से संबंधित मैकुलर अपघटन। इसलिए, प्राथमिक आरपीई कोशिकाओं के एक इन विट्रो कल्चर मॉडल की स्थापना, जो सेल लाइनों की तुलना में विवो में आरपीई से अधिक निकटता से मिलती-जुलती है, आरपीई कोशिकाओं की विशेषता और यांत्रिक अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण है। इस तथ्य को ध्यान में रखते हुए कि मानव नेत्रगोलक का स्रोत सीमित है, हम प्राथमिक पोर्सिन आरपीई कोशिकाओं को कल्चर करने के लिए एक प्रोटोकॉल बनाते हैं। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके, आरपीई कोशिकाओं को आसानी से वयस्क पोर्सिन नेत्रगोलक से अलग किया जा सकता है। इसके बाद, ये अलग-अलग कोशिकाएं कल्चर व्यंजनों / इंसर्ट से जुड़ जाती हैं, एक कॉन्फ्लुएंट मोनोलेयर बनाने के लिए प्रसार करती हैं, और जल्दी से 2 डब्ल्यूके के भीतर विवो में उपकला ऊतक की प्रमुख विशेषताओं को फिर से स्थापित करती हैं। क्यूआरटी-पीसीआर द्वारा, यह प्रदर्शित किया गया है कि प्राथमिक पोर्सिन आरपीई कोशिकाएं देशी आरपीई ऊतक के साथ तुलनीय स्तरों पर कई हस्ताक्षर जीन व्यक्त करती हैं, जबकि इनमें से अधिकांश जीनों की अभिव्यक्ति मानव आरपीई जैसी कोशिकाओं, एआरपीई -19 में खो जाती है / अत्यधिक कम हो जाती है। इसके अलावा, इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधलापन तंग जंक्शन, ऊतक ध्रुवीयता और साइटोस्केलेटन प्रोटीन के वितरण को दर्शाता है, साथ ही सुसंस्कृत प्राथमिक कोशिकाओं में विटामिन ए चयापचय के लिए महत्वपूर्ण आइसोमेरेज़ आरपीई 65 की उपस्थिति को दर्शाता है। कुल मिलाकर, हमने उच्च शुद्धता और देशी आरपीई विशेषताओं के साथ प्राथमिक पोर्सिन आरपीई कोशिकाओं को कल्चर करने के लिए एक आसान-से-पालन दृष्टिकोण विकसित किया है, जो आरपीई फिजियोलॉजी को समझने, सेल विषाक्तता का अध्ययन करने और दवा स्क्रीनिंग की सुविधा के लिए एक अच्छे मॉडल के रूप में काम कर सकता है।
Introduction
रेटिना वर्णक उपकला (आरपीई) रेटिना1 की बाहरी परत में फोटोरिसेप्टर और कोरियोकेशिकाओं के बीच कई कार्यों के साथ स्थित है, जिसमें रक्त-रेटिना बाधा बनाना, पोषक तत्वों और रेटिना मेटाबोलाइट्स का परिवहन और आदान-प्रदान करना, सामान्य दृश्य चक्र बनाए रखने के लिए विटामिन ए का पुनर्चक्रण, और फागोसाइटोसिस और शेड फोटोरिसेप्टर बाहरी खंडों (पीओएस) की निकासी शामिल है। . चूंकि पीओएस को दृष्टि उत्पन्न करने के लिए निरंतर आत्म-नवीकरण की आवश्यकता होती है, इसलिए आरपीई कोशिकाओं को रेटिना होमियोस्टेसिस4 को बनाए रखने के लिए अलग-अलग पीओएस को लगातार घेरने की आवश्यकता होती है। इसलिए, आरपीई डिसफंक्शन के परिणामस्वरूप कई अंधा आंखों के रोग होते हैं, जैसे कि उम्र से संबंधित मैकुलर अपघटन (एएमडी)4, रेटिनाइटिस पिगमेंटोसा (आरपी)5, लेबर जन्मजात एमौरोसिस6, मधुमेह रेटिनोपैथी7, आदि। अब तक, इनमें से अधिकांश बीमारियों का सटीक रोगजनन अभी भी अज्ञात है। नतीजतन, आरपीई सेल कल्चर आरपीई सेल जीव विज्ञान, पैथोलॉजिकल परिवर्तन और अंतर्निहित तंत्र का अध्ययन करने के लिए स्थापित किया गया है।
सेल जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए सबसे सरल मॉडल के रूप में, आरपीई कोशिकाओं की संस्कृति 1920 के दशक की शुरुआत में शुरूहुई थी। यद्यपि एआरपीई -19 का व्यापक रूप से आरपीई कोशिकाओं के रूप में उपयोग किया जाता है, पिग्मेंटेशन का नुकसान, कोबलस्टोन आकृति विज्ञान, और, विशेष रूप से, इस सेल लाइन में बाधा कार्य बहुत सारी चिंताएं उठातेहैं। इसकी तुलना में, प्राथमिक मानव आरपीई कोशिकाओं की संस्कृति शारीरिक और पैथोलॉजिकल अध्ययनों के लिए अधिक यथार्थवादी परिदृश्य प्रदान करतीहै। हालांकि, अपेक्षाकृत सीमित उपलब्धता उनके उपयोग को प्रतिबंधित करती है और नैतिक मुद्दे हमेशा मौजूद होते हैं। इसके अलावा, कई समूहों ने आरपीई कोशिकाओं को कल्चर करने के लिए माउस मॉडल का उपयोग किया। हालांकि, माउस आंख का आकार छोटा है, और एक एकल संस्कृति को आमतौर पर कई चूहों की आवश्यकता होती है, जो सुविधाजनक नहीं है। हाल ही में, वैज्ञानिकों ने आरपीई कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं या प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं का उपयोग करने के लिए नए तरीके विकसित किए हैं। यद्यपि इस तकनीक में विरासत में मिले आरपीई विकारों के उपचार के लिए विशेष क्षमता है, यह समय लेने वाली है और आमतौर पर परिपक्व आरपीईकोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए कई महीनों की आवश्यकता होती है। इन समस्याओं को दूर करने के लिए, यहां हम प्रयोगशाला में नियमित रूप से उच्च शुद्धता वाले आरपीई कोशिकाओं को अलग करने और संस्कृति करने के लिए एक आसान-से-पालन प्रोटोकॉल पेश करते हैं। उपयुक्त संस्कृति स्थितियों के तहत, ये कोशिकाएं विशिष्ट आरपीई कार्यों को प्रदर्शित कर सकती हैं और विशिष्ट आरपीई आकृति विज्ञान प्रदर्शित कर सकती हैं। इसलिए, यह संस्कृति विधि आरपीई फिजियोलॉजी को समझने, साइटोटॉक्सिसिटी का अध्ययन करने, संबंधित ओकुलर रोगों के पैथोलॉजिकल तंत्र की जांच करने और दवा स्क्रीनिंग का संचालन करने के लिए एक अच्छा मॉडल प्रदान कर सकती है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां, पोर्सिन नेत्रगोलक से आरपीई कोशिकाओं के अलगाव, संस्कृति और लक्षण वर्णन के लिए एक विस्तृत और अनुकूलित प्रोटोकॉल, जो आरपीई कोशिकाओं और आरपीई से संबंधित विकार अध्ययनों के इन विट्रो लक्षण वर्णन क?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक इस अध्ययन में अपनी कोशिकाओं का योगदान करने वाले सभी जानवरों के प्रति अपनी कृतज्ञता और सम्मान दिखाना चाहते हैं। इस अध्ययन को चीन के राष्ट्रीय कुंजी अनुसंधान एवं विकास कार्यक्रम (2019वाईएफए0111200, यी लियाओ और युआन गाओ और अनुदान संख्या 2018वाईएफए 0107301, वेई ली) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। लेखकों ने कॉन्फोकल इमेजिंग में तकनीकी सहायता के लिए सेंट्रल लैब, स्कूल ऑफ मेडिसिन, ज़ियामेन विश्वविद्यालय से जिंगरू हुआंग और जियांग यू को धन्यवाद दिया।
Materials
| ARPE-19 cells | CCTCC | GDC0323 | |
| Bovine serum albumin | Yeasen | 36101ES60 | |
| Confocal microscopy | Zeiss | LSM 880 with Airyscan | |
| ChemiDoc Touch | Bio-Rad | 1708370 | |
| Cell scraper | Sangon | F619301 | |
| 10 cm culture dish | NEST | 121621EH01 | |
| 12-well culture plate | NEST | 29821075P | |
| DMEM F12 Medium | Gibco | C11330500BT | |
| DMEM basic Medium | Gibco | C11995500BT | |
| EVOM2 | World Precision Instruments | EVOM2 | For TER measurement |
| Fetal bovine serum | ExCell Bio | FSP500 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11034 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A-11012 | |
| Goat anti Mouse IgG (H/L):HRP | Bio-Rad | 0300-0108P | |
| Goat anti Rabbit IgG (H/L):HRP | Bio-Rad | 5196-2504 | |
| hydrocortisone | MCE | HY-N0583/CS-2226 | |
| Hoechst 33342 solution (20 mM) | ThermoFisher Scientific | 62249 | |
| LightCycler 96 Instrument | Roche | 5815916001 | |
| Liothyronine | MCE | HY-A0070A/CS-4141 | |
| laminin | Sigma-Aldrich | L2020-1MG | |
| MEM(1X)+GlutaMAX Medium | Gibco | 10566-016 | |
| MEM NEAA(100X) | Gibco | 11140-050 | |
| Millex-GP syringe filter unit | Millipore | SLGPR33RB | |
| N1 | Sigma-Aldrich | SLCF4683 | |
| NcmECL Ultra | New Cell&Molecular Biotech | P10300 | |
| Non-fat Powdered Milk | Solarbio | D8340 | |
| Nicotinamide | SparkJade | SJ-MV0061 | |
| Na+-K+ ATPase antibody | Abcam | ab76020 | Recognize both human and porcine proteins |
| PAGE Gel Fast Preparation Kit(10%) | Epizyme | PG112 | |
| primary Human RPE cells | – | – | Generous gift from Shoubi Wang lab |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| Prism | GraphPad by Dotmatics | version 8.0 | |
| Protease Inhibitor Cocktails | APExBIO | K1024 | |
| PRE65 antibody | Proteintech | 17939-1-AP | Recognize both human and porcine proteins |
| PEDF antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-390172 | Recognize both human and porcine proteins |
| 100 x penicillin/streptomycin | Biological Industries | 03-031-1BCS | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | RARBIO | RA-9005 | |
| ReverTra Ace qPCR RT Master Mix | Toyobo | FSQ-201 | |
| RIPA buffer | ThermoFisher Scientific | 89900 | |
| 15 mL sterile centrifuge tubes | NEST | 601052 | |
| 50 mL sterile centrifuge tubes | NEST | 602052 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| Taurine | Damas-beta | 107-35-7 | |
| Trizol | Thermo-Fisher | 15596026 | RNA extraction solution |
| TB Green Fast qPCR Mix | Takara | RR430A | |
| 12-well transwell inserts | Labselect | 14212 | |
| VEGF antibody | Proteintech | 19003-1-AP | Recognize both human and porcine proteins |
| VEGF ELISA kit | Novusbio | VAL106 | |
| ZO-1 antibody | ABclonal | A0659 | Recognize both human and porcine proteins |
References
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