돼지 망막 색소 상피 세포의 1 차 배양
Summary
여기서, 시험 관 내에서 일차 돼지 망막 색소 상피세포를 배양하는 방법을 제시한다.
Abstract
망막 색소 상피 (RPE)는 망막의 맥락막과 신경 망막 사이에 위치한 편광 색소 상피 세포의 단층입니다. 식균 작용, 영양소/대사 산물 수송, 비타민 A 대사 등을 포함한 여러 기능이 RPE에 의해 매일 수행됩니다. RPE 세포는 재생 능력이 거의 또는 전혀 없는 말기 분화된 상피 세포입니다. RPE 세포의 손실은 연령 관련 황반 변성과 같은 시각 장애로 이어지는 여러 안과 질환을 초래합니다. 따라서 세포주보다 RPE in vivo와 더 유사한 1차 RPE 세포의 시험관 내 배양 모델을 구축하는 것은 RPE 세포의 특성 및 기계론적 연구에 매우 중요합니다. 인간의 안구의 공급원이 제한적이라는 사실을 고려하여 우리는 1 차 돼지 RPE 세포를 배양하기위한 프로토콜을 만듭니다. 이 프로토콜을 사용하면 RPE 세포를 성인 돼지 안구에서 쉽게 분리 할 수 있습니다. 그 후, 이러한 해리된 세포는 배양 접시/삽입물에 부착되고, 증식하여 합류 단층을 형성하고, 2주 이내에 생체 내 상피 조직의 주요 특징을 빠르게 재설정합니다. qRT-PCR에 의해, 1차 돼지 RPE 세포는 천연 RPE 조직과 유사한 수준에서 여러 시그니처 유전자를 발현하는 반면, 이러한 유전자의 대부분은 인간 RPE 유사 세포인 ARPE-19에서 손실/고도로 감소한다는 것이 입증되었습니다. 또한 면역형광 염색은 배양된 일차 세포에서 긴밀한 접합, 조직 극성 및 세포골격 단백질의 분포와 비타민 A 대사에 중요한 이성질화효소인 RPE65의 존재를 보여줍니다. 전체적으로 우리는 고순도 및 천연 RPE 기능을 가진 1차 돼지 RPE 세포 배양에 대한 따라하기 쉬운 접근 방식을 개발했으며, 이는 RPE 생리학을 이해하고 세포 독성을 연구하며 약물 스크리닝을 용이하게 하는 좋은 모델이 될 수 있습니다.
Introduction
망막 색소 상피(RPE)는 망막1 외층의 광수용체와 맥락모세혈관 사이에 위치하며, 혈액-망막 장벽 형성, 영양소 및 망막 대사산물 운반 및 교환, 정상적인 시각 주기를 유지하기 위한 비타민 A 재활용, 식균작용 및 흘린 광수용체 외부 분절(POS)의 제거를 포함한 여러기능을 수행합니다.2,3 . POS는 시력을 생성하기 위해 지속적인자가 갱신이 필요하기 때문에 RPE 세포는 망막 항상성을 유지하기 위해 분리 된 POS를 지속적으로 삼켜야합니다4. 따라서 RPE 기능 장애는 연령 관련 황반 변성(AMD)4, 색소성 망막염(RP)5, Leber 선천성 무균증6, 당뇨병성 망막증7 등과 같은 많은 실명 안과 질환을 유발합니다. 지금까지 이러한 질병의 정확한 발병 기전은 아직 파악하기 어렵습니다. 결과적으로 RPE 세포 생물학, 병리학적 변화 및 기본 메커니즘을 연구하기 위해 RPE 세포 배양이 확립되었습니다.
세포 생물학을 연구하는 가장 간단한 모델로서, RPE 세포의 배양은 이미 1920년대에 시작되었다8. ARPE-19가 RPE 세포로서 널리 사용되고 있지만, 색소 침착, 조약돌 형태, 특히 이 세포주의 장벽 기능의 손실은많은 우려를 불러일으킨다9. 이에 비해, 일차 인간 RPE 세포의 배양은 생리학적 및 병리학적 연구를 위한 보다 현실적인 시나리오를 제공한다9. 그러나 상대적으로 제한된 가용성으로 인해 사용이 제한되고 윤리적 문제가 항상 존재합니다. 또한 여러 그룹이 마우스 모델을 사용하여 RPE 세포를 배양했습니다. 그러나 마우스 눈의 크기가 작고 단일 배양에는 일반적으로 많은 마우스가 필요하므로 편리하지 않습니다9. 최근 과학자들은 인간 배아 줄기 세포 또는 유도 만능 줄기 세포를 사용하여 RPE 세포를 유도하는 새로운 방법을 개발했습니다. 비록 이 기술이 유전된 RPE 장애의 치료를 위한 특별한 잠재력을 갖지만, 이는 시간이 많이 걸리고 보통 성숙한 RPE 세포(10)를 생성하는데 수개월이 필요하다. 이러한 문제를 극복하기 위해 실험실에서 고순도 RPE 세포를 일상적으로 분리하고 배양하는 따라하기 쉬운 프로토콜을 소개합니다. 적절한 배양 조건 하에서, 이들 세포는 전형적인 RPE 기능을 나타내고 전형적인 RPE 형태를 나타낼 수 있다. 따라서이 배양 방법은 RPE 생리학을 이해하고, 세포 독성을 연구하고, 관련 안구 질환의 병리학 적 메커니즘을 조사하고, 약물 스크리닝을 수행하는 좋은 모델을 제공 할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에서는 RPE 세포의 시험관 내 특성화 및 RPE 관련 장애 연구를 위한 좋은 모델을 생성하는 돼지 안구에서 RPE 세포의 분리, 배양 및 특성화를 위한 상세하고 최적화된 프로토콜이 설명되었습니다. 인간, 마우스 및 래트 눈으로부터 RPE를 단리하기 위한 방법은 이전에23,24,25에 기술되었다. 그러나 일부 실험실에서는 사람…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는이 연구에서 세포에 기여한 모든 동물에게 감사와 존경을 표하고 싶습니다. 이 연구는 중국 국가 핵심 R & D 프로그램 (2019YFA0111200, Yi Liao & Yuan Gao 및 Grant nos. 2018YFA0107301, Wei Li)의 보조금으로 부분적으로 지원되었습니다. 저자는 컨포칼 이미징에 대한 기술 지원에 대해 샤먼 대학교 의과대학 중앙 연구소의 Jingru Huang과 Xiang You에게 감사를 표합니다.
Materials
| ARPE-19 cells | CCTCC | GDC0323 | |
| Bovine serum albumin | Yeasen | 36101ES60 | |
| Confocal microscopy | Zeiss | LSM 880 with Airyscan | |
| ChemiDoc Touch | Bio-Rad | 1708370 | |
| Cell scraper | Sangon | F619301 | |
| 10 cm culture dish | NEST | 121621EH01 | |
| 12-well culture plate | NEST | 29821075P | |
| DMEM F12 Medium | Gibco | C11330500BT | |
| DMEM basic Medium | Gibco | C11995500BT | |
| EVOM2 | World Precision Instruments | EVOM2 | For TER measurement |
| Fetal bovine serum | ExCell Bio | FSP500 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11034 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A-11012 | |
| Goat anti Mouse IgG (H/L):HRP | Bio-Rad | 0300-0108P | |
| Goat anti Rabbit IgG (H/L):HRP | Bio-Rad | 5196-2504 | |
| hydrocortisone | MCE | HY-N0583/CS-2226 | |
| Hoechst 33342 solution (20 mM) | ThermoFisher Scientific | 62249 | |
| LightCycler 96 Instrument | Roche | 5815916001 | |
| Liothyronine | MCE | HY-A0070A/CS-4141 | |
| laminin | Sigma-Aldrich | L2020-1MG | |
| MEM(1X)+GlutaMAX Medium | Gibco | 10566-016 | |
| MEM NEAA(100X) | Gibco | 11140-050 | |
| Millex-GP syringe filter unit | Millipore | SLGPR33RB | |
| N1 | Sigma-Aldrich | SLCF4683 | |
| NcmECL Ultra | New Cell&Molecular Biotech | P10300 | |
| Non-fat Powdered Milk | Solarbio | D8340 | |
| Nicotinamide | SparkJade | SJ-MV0061 | |
| Na+-K+ ATPase antibody | Abcam | ab76020 | Recognize both human and porcine proteins |
| PAGE Gel Fast Preparation Kit(10%) | Epizyme | PG112 | |
| primary Human RPE cells | – | – | Generous gift from Shoubi Wang lab |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| Prism | GraphPad by Dotmatics | version 8.0 | |
| Protease Inhibitor Cocktails | APExBIO | K1024 | |
| PRE65 antibody | Proteintech | 17939-1-AP | Recognize both human and porcine proteins |
| PEDF antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-390172 | Recognize both human and porcine proteins |
| 100 x penicillin/streptomycin | Biological Industries | 03-031-1BCS | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | RARBIO | RA-9005 | |
| ReverTra Ace qPCR RT Master Mix | Toyobo | FSQ-201 | |
| RIPA buffer | ThermoFisher Scientific | 89900 | |
| 15 mL sterile centrifuge tubes | NEST | 601052 | |
| 50 mL sterile centrifuge tubes | NEST | 602052 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| Taurine | Damas-beta | 107-35-7 | |
| Trizol | Thermo-Fisher | 15596026 | RNA extraction solution |
| TB Green Fast qPCR Mix | Takara | RR430A | |
| 12-well transwell inserts | Labselect | 14212 | |
| VEGF antibody | Proteintech | 19003-1-AP | Recognize both human and porcine proteins |
| VEGF ELISA kit | Novusbio | VAL106 | |
| ZO-1 antibody | ABclonal | A0659 | Recognize both human and porcine proteins |
References
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