Primær kultur av svin retinal pigment epitelceller
Summary
Her presenteres en lett å følge metode for å dyrke primære svin retinale pigmentepitelceller in vitro .
Abstract
Retinalpigmentepitelet (RPE) er et monolag av polariserte pigmenterte epitelceller, lokalisert mellom choroid og neuroretina i netthinnen. Flere funksjoner, inkludert fagocytose, næringsstoff / metabolitttransport, vitamin A-metabolisme, etc., utføres av RPE på daglig basis. RPE-celler er terminalt differensierte epitelceller med liten eller ingen regenerativ kapasitet. Tap av RPE-celler resulterer i flere øyesykdommer som fører til synshemming, for eksempel aldersrelatert makuladegenerasjon. Derfor er etableringen av en in vitro-kulturmodell av primære RPE-celler, som ligner mer på RPE in vivo enn cellelinjer, kritisk for de karakteristiske og mekanistiske studiene av RPE-celler. Tatt i betraktning det faktum at kilden til menneskelige øyeboller er begrenset, lager vi en protokoll for å dyrke primære svin RPE-celler. Ved å bruke denne protokollen kan RPE-celler lett dissosieres fra voksne svin øyeboller. Deretter fester disse dissosierte cellene seg til kulturretter / innsatser, sprer seg for å danne et sammenflytende monolag, og gjenoppretter raskt viktige trekk ved epitelvev in vivo innen 2 wks. Ved qRT-PCR er det demonstrert at primære svin RPE-celler uttrykker flere signaturgener på sammenlignbare nivåer med innfødt RPE-vev, mens uttrykkene til de fleste av disse genene går tapt / sterkt redusert i humane RPE-lignende celler, ARPE-19. Videre viser immunfluorescensfargingen fordelingen av tett kryss, vevspolaritet og cytoskelettproteiner, samt tilstedeværelsen av RPE65, en isomerase som er kritisk for vitamin A-metabolisme, i dyrkede primære celler. Til sammen har vi utviklet en lett-å-følge tilnærming til kultur primære svin RPE celler med høy renhet og innfødte RPE funksjoner, som kan tjene som en god modell for å forstå RPE fysiologi, studere celletoksisitet, og lette narkotika screenings.
Introduction
Retinalpigmentepitelet (RPE) ligger mellom fotoreceptorer og choriocapillaris i det ytre laget av retina1 med flere funksjoner, inkludert dannelse av blod-retinalbarrieren, transport og utveksling av næringsstoffer og retinale metabolitter, resirkulering av vitamin A for å opprettholde en normal visuell syklus, og fagocytose og clearance av skurfotoreceptor ytre segmenter (POS)2,3 . Siden POS-er krever konstant selvfornyelse for å generere syn, må RPE-cellene kontinuerlig oppsluke frittliggende POS-er for å opprettholde retinal homeostase4. Derfor resulterer RPE-dysfunksjon i mange blinde øyesykdommer, som aldersrelatert makuladegenerasjon (AMD)4, retinitis pigmentosa (RP)5, Leber medfødt amaurose6, diabetisk retinopati7, etc. Til nå er den eksakte patogenesen av de fleste av disse sykdommene fortsatt unnvikende. Som et resultat er RPE-cellekultur etablert for å studere RPE-cellebiologi, patologiske forandringer og underliggende mekanismer.
Som den enkleste modellen for å studere cellebiologi ble kulturen til RPE-celler startet så tidlig som på 1920-tallet8. Selv om ARPE-19 er mye brukt som RPE-celler, gir tap av pigmentering, brosteinsmorfologi, og spesielt barrierefunksjonene i denne cellelinjen mange bekymringer9. Til sammenligning tilbyr kulturen til primære humane RPE-celler et mer realistisk scenario for fysiologiske og patologiske studier9. Den relativt begrensede tilgjengeligheten begrenser imidlertid bruken av dem, og etiske problemer eksisterer alltid. I tillegg brukte flere grupper musemodeller for å dyrke RPE-celler. Imidlertid er størrelsen på museøyet liten, og en enkelt kultur krever vanligvis mange mus, noe som ikke er praktisk9. Nylig har forskere utviklet nye metoder for å bruke menneskelige embryonale stamceller eller induserte pluripotente stamceller for å utlede RPE-celler. Selv om denne teknikken har spesielt potensial for behandling av arvelige RPE-lidelser, er den tidkrevende og krever vanligvis flere måneder å generere modne RPE-celler10. For å overvinne disse problemene, introduserer vi her en lett å følge protokoll for å isolere og dyrke RPE-celler med høy renhet i laboratoriet rutinemessig. Under egnede kulturforhold kan disse cellene vise typiske RPE-funksjoner og vise typiske RPE-morfologier. Derfor kan denne kulturmetoden gi en god modell for å forstå RPE-fysiologi, studere cytotoksisitet, undersøke patologiske mekanismer for relaterte okulære sykdommer og gjennomføre narkotikaundersøkelser.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her er det beskrevet en detaljert og optimalisert protokoll for isolering, kultur og karakterisering av RPE-celler fra svin øyeboller, som genererer en god modell for in vitro-karakterisering av RPE-celler og RPE-relaterte lidelsesstudier. Metoder for isolering av RPE fra menneske-, mus- og rotteøyne har tidligere blitt beskrevet23,24,25. Det er imidlertid vanskelig å få tak i menneskelige øyeepler i noen laborator…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne ønsker å vise sin takknemlighet og respekt for alle dyr som bidrar med sine celler i denne studien. Denne studien ble delvis støttet av tilskudd fra National Key R&D Program of China (2019YFA0111200, Yi Liao & Yuan Gao og Grant nr. 2018YFA0107301, Wei Li). Forfatterne takker Jingru Huang og Xiang You fra Central Lab, School of Medicine, Xiamen University for teknisk støtte i konfokal bildebehandling.
Materials
| ARPE-19 cells | CCTCC | GDC0323 | |
| Bovine serum albumin | Yeasen | 36101ES60 | |
| Confocal microscopy | Zeiss | LSM 880 with Airyscan | |
| ChemiDoc Touch | Bio-Rad | 1708370 | |
| Cell scraper | Sangon | F619301 | |
| 10 cm culture dish | NEST | 121621EH01 | |
| 12-well culture plate | NEST | 29821075P | |
| DMEM F12 Medium | Gibco | C11330500BT | |
| DMEM basic Medium | Gibco | C11995500BT | |
| EVOM2 | World Precision Instruments | EVOM2 | For TER measurement |
| Fetal bovine serum | ExCell Bio | FSP500 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11034 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A-11012 | |
| Goat anti Mouse IgG (H/L):HRP | Bio-Rad | 0300-0108P | |
| Goat anti Rabbit IgG (H/L):HRP | Bio-Rad | 5196-2504 | |
| hydrocortisone | MCE | HY-N0583/CS-2226 | |
| Hoechst 33342 solution (20 mM) | ThermoFisher Scientific | 62249 | |
| LightCycler 96 Instrument | Roche | 5815916001 | |
| Liothyronine | MCE | HY-A0070A/CS-4141 | |
| laminin | Sigma-Aldrich | L2020-1MG | |
| MEM(1X)+GlutaMAX Medium | Gibco | 10566-016 | |
| MEM NEAA(100X) | Gibco | 11140-050 | |
| Millex-GP syringe filter unit | Millipore | SLGPR33RB | |
| N1 | Sigma-Aldrich | SLCF4683 | |
| NcmECL Ultra | New Cell&Molecular Biotech | P10300 | |
| Non-fat Powdered Milk | Solarbio | D8340 | |
| Nicotinamide | SparkJade | SJ-MV0061 | |
| Na+-K+ ATPase antibody | Abcam | ab76020 | Recognize both human and porcine proteins |
| PAGE Gel Fast Preparation Kit(10%) | Epizyme | PG112 | |
| primary Human RPE cells | – | – | Generous gift from Shoubi Wang lab |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| Prism | GraphPad by Dotmatics | version 8.0 | |
| Protease Inhibitor Cocktails | APExBIO | K1024 | |
| PRE65 antibody | Proteintech | 17939-1-AP | Recognize both human and porcine proteins |
| PEDF antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-390172 | Recognize both human and porcine proteins |
| 100 x penicillin/streptomycin | Biological Industries | 03-031-1BCS | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | RARBIO | RA-9005 | |
| ReverTra Ace qPCR RT Master Mix | Toyobo | FSQ-201 | |
| RIPA buffer | ThermoFisher Scientific | 89900 | |
| 15 mL sterile centrifuge tubes | NEST | 601052 | |
| 50 mL sterile centrifuge tubes | NEST | 602052 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| Taurine | Damas-beta | 107-35-7 | |
| Trizol | Thermo-Fisher | 15596026 | RNA extraction solution |
| TB Green Fast qPCR Mix | Takara | RR430A | |
| 12-well transwell inserts | Labselect | 14212 | |
| VEGF antibody | Proteintech | 19003-1-AP | Recognize both human and porcine proteins |
| VEGF ELISA kit | Novusbio | VAL106 | |
| ZO-1 antibody | ABclonal | A0659 | Recognize both human and porcine proteins |
References
- Tan, L. X., Germer, C. J., La Cunza, N., Lakkaraju, A. Complement activation, lipid metabolism, and mitochondrial injury: Converging pathways in age-related macular degeneration. Redox Biology. 37, 101781 (2020).
- Caceres, P. S., Rodriguez-Boulan, E. Retinal pigment epithelium polarity in health and blinding diseases. Current Opinion in Cell Biology. 62, 37-45 (2020).
- Lakkaraju, A., et al. The cell biology of the retinal pigment epithelium. Progress in Retinal and Eye Research. 78, 100846 (2020).
- Somasundaran, S., Constable, I. J., Mellough, C. B., Carvalho, L. S. Retinal pigment epithelium and age-related macular degeneration: A review of major disease mechanisms. Clinical & Experimental Ophthalmology. 48 (8), 1043-1056 (2020).
- Ducloyer, J. B., Le Meur, G., Cronin, T., Adjali, O., Weber, M. Gene therapy for retinitis pigmentosa. Medecine Sciences. 36 (6-7), 607-615 (2020).
- den Hollander, A. I., Roepman, R., Koenekoop, R. K., Cremers, F. P. Leber congenital amaurosis: genes, proteins and disease mechanisms. Progress in Retinal and Eye Research. 27 (4), 391-419 (2008).
- Samuels, I. S., Bell, B. A., Pereira, A., Saxon, J., Peachey, N. S. Early retinal pigment epithelium dysfunction is concomitant with hyperglycemia in mouse models of type 1 and type 2 diabetes. Journal of Neurophysiology. 113 (4), 1085-1099 (2015).
- Smith, D. T. Melanin pigment in the pigmented epithelium of the retina of the embryo chick eye studied in vivo and in vino. The Anatomical Record. 18, 260-261 (1920).
- Schnichels, S., et al. Retina in a dish: Cell cultures, retinal explants and animal models for common diseases of the retina. Progress in Retinal and Eye Research. 81, 100880 (2021).
- D’Antonio-Chronowska, A., D’Antonio, M., Frazer, K. A. In vitro differentiation of human iPSC-derived retinal pigment epithelium cells (iPSC-RPE). Bio-Protocol. 9 (24), 3469 (2019).
- Hazim, R. A., Volland, S., Yen, A., Burgess, B. L., Williams, D. S. Rapid differentiation of the human RPE cell line, ARPE-19, induced by nicotinamide. Experimental Eye Research. 179, 18-24 (2019).
- Dunn, K. C., Aotaki-Keen, A. E., Putkey, F. R., Hjelmeland, L. M. ARPE-19, a human retinal pigment epithelial cell line with differentiated properties. Experimental Eye Research. 62 (2), 155-169 (1996).
- . Scientific, T Available from: https://www.thermofisher.cn/document-connect/document (2022)
- . Toyota Available from: https://www.toyoboglobal.com/seihin/xr/likescience/support/manual/FSQ-201.pdf (2022)
- . Abcam Available from: https://www.abcam.cn/protocols/immunocytochemistry-immunofluorescence-protocol (2022)
- . Zeiss Available from: https://www.zeiss.com/microscopy/en/products/software/zeiss-zen-lite.html#manuals (2022)
- . Cell Signal Technology Available from: https://www.cellsignal.cn/learn-and-support/protocols/protocol-western (2022)
- Wang, S., et al. Reversed senescence of retinal pigment epithelial cell by coculture with embryonic stem cell via the TGFbeta and PI3K pathways. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 588050 (2020).
- Pfeffer, B. A., Philp, N. J. Cell culture of retinal pigment epithelium: Special Issue. Experimental Eye Research. 126, 1-4 (2014).
- Lehmann, G. L., Benedicto, I., Philp, N. J., Rodriguez-Boulan, E. Plasma membrane protein polarity and trafficking in RPE cells: past, present and future. Experimental Eye Research. 126, 5-15 (2014).
- Anderson, J. M., Van Itallie, C. M. Physiology and function of the tight junction. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (2), 002584 (2009).
- Nita, M., Strzalka-Mrozik, B., Grzybowski, A., Mazurek, U., Romaniuk, W. Age-related macular degeneration and changes in the extracellular matrix. Medical Science Monitor. 20, 1003-1016 (2014).
- Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells. Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).
- Langenfeld, A., Julien, S., Schraermeyer, U. An improved method for the isolation and culture of retinal pigment epithelial cells from adult rats. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 253 (9), 1493-1502 (2015).
- Sonoda, S. A protocol for the culture and differentiation of highly polarized human retinal pigment epithelial cells. Nature Protocols. 4 (5), 662-673 (2009).
