Cultura Primária de Células Epiteliais do Pigmento da Retina Suína
Summary
Aqui, um método fácil de seguir para a cultura de células epiteliais primárias do pigmento da retina suína in vitro é apresentado.
Abstract
O epitélio pigmentar da retina (EPR) é uma monocamada de células epiteliais pigmentadas polarizadas, localizadas entre a coroide e a neurorretina na retina. Múltiplas funções, incluindo fagocitose, transporte de nutrientes / metabólitos, metabolismo da vitamina A, etc., são conduzidas pelo PSE diariamente. As células PSE são células epiteliais terminalmente diferenciadas com pouca ou nenhuma capacidade regenerativa. A perda de células PSE resulta em múltiplas doenças oculares que levam à deficiência visual, como a degeneração macular relacionada à idade. Portanto, o estabelecimento de um modelo de cultura in vitro de células primárias de EPR, que mais se assemelha ao PSE in vivo do que linhagens celulares, é fundamental para os estudos característicos e mecanicistas de células de EPR. Considerando o fato de que a fonte de globos oculares humanos é limitada, criamos um protocolo para cultivar células primárias de PSE suína. Usando este protocolo, as células RPE podem ser facilmente dissociadas dos globos oculares suínos adultos. Posteriormente, essas células dissociadas se ligam a placas / inserções de cultura, proliferam para formar uma monocamada confluente e restabelecem rapidamente as principais características do tecido epitelial in vivo dentro de 2 semanas. Por qRT-PCR, demonstra-se que as células primárias de PSE suína expressam múltiplos genes de assinatura em níveis comparáveis com o tecido RPE nativo, enquanto as expressões da maioria desses genes são perdidas/altamente reduzidas em células humanas semelhantes a RPE, ARPE-19. Além disso, a coloração por imunofluorescência mostra a distribuição de proteínas de junção apertada, polaridade tecidual e citoesqueleto, bem como a presença de RPE65, uma isomerase crítica para o metabolismo da vitamina A, em células primárias cultivadas. No total, desenvolvemos uma abordagem fácil de seguir para cultivar células primárias de PSE suíno com alta pureza e características nativas de RPE, o que poderia servir como um bom modelo para entender a fisiologia da EPR, estudar toxicidades celulares e facilitar exames de drogas.
Introduction
O epitélio pigmentar da retina (EPR) está localizado entre fotorreceptores e coriocapilares na camada externa da retina1 com múltiplas funções, incluindo a formação da barreira sangue-retina, transporte e troca de nutrientes e metabólitos da retina, reciclagem de vitamina A para manter um ciclo visual normal e fagocitose e depuração dos segmentos externos fotorreceptores (POSs)2,3 . Como os POSs requerem auto-renovação constante para gerar visão, as células RPE precisam engolir continuamente os POSs destacados para manter a homeostase da retina4. Portanto, a disfunção do PSE resulta em muitas doenças oculares cegantes, como degeneração macular relacionada à idade (DMRI)4, retinite pigmentosa (RP)5, amaurose congênita de Leber6, retinopatia diabética7, etc. Até agora, a patogênese exata da maioria dessas doenças permanece indescritível. Como resultado, a cultura de células RPE é estabelecida para estudar a biologia celular RPE, alterações patológicas e mecanismos subjacentes.
Como o modelo mais simples para estudar a biologia celular, a cultura de células RPE foi iniciada já na década de 19208. Embora o ARPE-19 seja amplamente utilizado como células RPE, a perda de pigmentação, a morfologia do paralelepípedo e, especialmente, as funções de barreira nessa linhagem celular levantam muitas preocupações9. Em comparação, a cultura de células primárias de EPR humanas oferece um cenário mais realista para estudos fisiológicos e patológicos9. No entanto, a disponibilidade relativamente limitada restringe seu uso e sempre existem questões éticas. Além disso, vários grupos usaram modelos de camundongos para cultivar células RPE. No entanto, o tamanho do olho do rato é pequeno, e uma única cultura geralmente requer muitos ratos, o que não é conveniente9. Recentemente, os cientistas desenvolveram novos métodos para usar células-tronco embrionárias humanas ou células-tronco pluripotentes induzidas para derivar células RPE. Embora essa técnica tenha um potencial particular para o tratamento de distúrbios hereditários do PSE, é demorada e geralmente requer vários meses para gerar células maduras do PSE10. Para superar esses problemas, aqui apresentamos um protocolo fácil de seguir para isolar e cultivar células RPE de alta pureza em laboratório rotineiramente. Sob condições de cultura adequadas, essas células podem exibir funções RPE típicas e exibir morfologias RPE típicas. Portanto, esse método de cultura pode fornecer um bom modelo para entender a fisiologia do EPR, estudar a citotoxicidade, investigar mecanismos patológicos de doenças oculares relacionadas e realizar exames de drogas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui, um protocolo detalhado e otimizado para o isolamento, cultura e caracterização de células RPE de globos oculares suínos, o que gera um bom modelo para caracterização in vitro de células RPE e estudos de distúrbios relacionados ao RPE foi descrito. Métodos para o isolamento do PSE de olhos humanos, camundongos e ratos foram descritos anteriormente23,24,25. No entanto, é difícil obter globos oculares huma…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de mostrar sua gratidão e respeito a todos os animais que contribuem com suas células neste estudo. Este estudo foi apoiado em parte por doações do Programa Nacional de P & D da China (2019YFA0111200, Yi Liao & Yuan Gao e Grant nos. 2018YFA0107301, Wei Li). Os autores agradecem a Jingru Huang e Xiang You do Laboratório Central, Escola de Medicina, Universidade de Xiamen, pelo apoio técnico em imagens confocais.
Materials
| ARPE-19 cells | CCTCC | GDC0323 | |
| Bovine serum albumin | Yeasen | 36101ES60 | |
| Confocal microscopy | Zeiss | LSM 880 with Airyscan | |
| ChemiDoc Touch | Bio-Rad | 1708370 | |
| Cell scraper | Sangon | F619301 | |
| 10 cm culture dish | NEST | 121621EH01 | |
| 12-well culture plate | NEST | 29821075P | |
| DMEM F12 Medium | Gibco | C11330500BT | |
| DMEM basic Medium | Gibco | C11995500BT | |
| EVOM2 | World Precision Instruments | EVOM2 | For TER measurement |
| Fetal bovine serum | ExCell Bio | FSP500 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11034 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A-11012 | |
| Goat anti Mouse IgG (H/L):HRP | Bio-Rad | 0300-0108P | |
| Goat anti Rabbit IgG (H/L):HRP | Bio-Rad | 5196-2504 | |
| hydrocortisone | MCE | HY-N0583/CS-2226 | |
| Hoechst 33342 solution (20 mM) | ThermoFisher Scientific | 62249 | |
| LightCycler 96 Instrument | Roche | 5815916001 | |
| Liothyronine | MCE | HY-A0070A/CS-4141 | |
| laminin | Sigma-Aldrich | L2020-1MG | |
| MEM(1X)+GlutaMAX Medium | Gibco | 10566-016 | |
| MEM NEAA(100X) | Gibco | 11140-050 | |
| Millex-GP syringe filter unit | Millipore | SLGPR33RB | |
| N1 | Sigma-Aldrich | SLCF4683 | |
| NcmECL Ultra | New Cell&Molecular Biotech | P10300 | |
| Non-fat Powdered Milk | Solarbio | D8340 | |
| Nicotinamide | SparkJade | SJ-MV0061 | |
| Na+-K+ ATPase antibody | Abcam | ab76020 | Recognize both human and porcine proteins |
| PAGE Gel Fast Preparation Kit(10%) | Epizyme | PG112 | |
| primary Human RPE cells | – | – | Generous gift from Shoubi Wang lab |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| Prism | GraphPad by Dotmatics | version 8.0 | |
| Protease Inhibitor Cocktails | APExBIO | K1024 | |
| PRE65 antibody | Proteintech | 17939-1-AP | Recognize both human and porcine proteins |
| PEDF antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-390172 | Recognize both human and porcine proteins |
| 100 x penicillin/streptomycin | Biological Industries | 03-031-1BCS | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | RARBIO | RA-9005 | |
| ReverTra Ace qPCR RT Master Mix | Toyobo | FSQ-201 | |
| RIPA buffer | ThermoFisher Scientific | 89900 | |
| 15 mL sterile centrifuge tubes | NEST | 601052 | |
| 50 mL sterile centrifuge tubes | NEST | 602052 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| Taurine | Damas-beta | 107-35-7 | |
| Trizol | Thermo-Fisher | 15596026 | RNA extraction solution |
| TB Green Fast qPCR Mix | Takara | RR430A | |
| 12-well transwell inserts | Labselect | 14212 | |
| VEGF antibody | Proteintech | 19003-1-AP | Recognize both human and porcine proteins |
| VEGF ELISA kit | Novusbio | VAL106 | |
| ZO-1 antibody | ABclonal | A0659 | Recognize both human and porcine proteins |
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