Domuz Retinal Pigment Epitel Hücrelerinin Primer Kültürü
Summary
Burada, primer domuz retinal pigment epitel hücrelerinin in vitro olarak kültürlenmesi için takip edilmesi kolay bir yöntem sunulmaktadır.
Abstract
Retina pigment epiteli (RPE), retinadaki koroid ve nöroretina arasında yer alan polarize pigmentli epitel hücrelerinin tek katmanıdır. Fagositoz, besin / metabolit taşınması, A vitamini metabolizması vb. dahil olmak üzere birçok fonksiyon RPE tarafından günlük olarak gerçekleştirilir. RPE hücreleri, rejeneratif kapasitesi çok az olan veya hiç olmayan terminal olarak farklılaşmış epitel hücreleridir. RPE hücrelerinin kaybı, yaşa bağlı makula dejenerasyonu gibi görme bozukluğuna yol açan çoklu göz hastalıklarına neden olur. Bu nedenle, RPE’ye hücre hatlarından daha çok benzeyen primer RPE hücrelerinin in vitro kültür modelinin oluşturulması, RPE hücrelerinin karakteristik ve mekanik çalışmaları için kritik öneme sahiptir. İnsan gözbebeklerinin kaynağının sınırlı olduğu gerçeğini göz önünde bulundurarak, birincil domuz RPE hücrelerini kültürlemek için bir protokol oluşturuyoruz. Bu protokolü kullanarak, RPE hücreleri yetişkin domuz gözbebeklerinden kolayca ayrılabilir. Daha sonra, bu ayrışmış hücreler kültür tabaklarına / eklerine bağlanır, akıcı bir tek katman oluşturmak için çoğalır ve epitel dokusunun temel özelliklerini in vivo olarak 2 wks içinde hızla yeniden oluşturur. qRT-PCR ile, birincil domuz RPE hücrelerinin doğal RPE dokusu ile karşılaştırılabilir seviyelerde çoklu imza genleri eksprese ettiği, bu genlerin çoğunun ekspresyonlarının insan RPE benzeri hücrelerde, ARPE-19’da kaybolduğu / yüksek oranda azaldığı gösterilmiştir. Ayrıca, immünofloresan boyama, sıkı birleşme, doku polaritesi ve sitoiskelet proteinlerinin dağılımını ve ayrıca kültürlenmiş primer hücrelerde A vitamini metabolizması için kritik bir izomeraz olan RPE65’in varlığını gösterir. Toplamda, RPE fizyolojisini anlamak, hücre toksisitelerini incelemek ve ilaç taramalarını kolaylaştırmak için iyi bir model olarak hizmet edebilecek yüksek saflıkta ve doğal RPE özelliklerine sahip birincil domuz RPE hücrelerinin kültürüne takip edilmesi kolay bir yaklaşım geliştirdik.
Introduction
Retinal pigment epiteli (RPE), retina1’in dış tabakasındaki fotoreseptörler ve koryokapillaris arasında bulunur ve kan-retinal bariyerin oluşturulması, besin maddelerinin ve retinal metabolitlerin taşınması ve değişimi, normal bir görme döngüsünü sürdürmek için A vitamininin geri dönüşümü ve fagositoz ve dökülen fotoreseptör dış segmentlerinin (POS’lar) temizlenmesi gibi birçok fonksiyona sahiptir2,3 . POS’lar görme üretmek için sürekli kendini yenilemeyi gerektirdiğinden, RPE hücrelerinin retinal homeostazı korumak için sürekli olarak ayrılmış POS’ları yutması gerekir4. Bu nedenle, RPE disfonksiyonu, yaşa bağlı makula dejenerasyonu (AMD)4, retinitis pigmentosa (RP)5, Leber konjenital amaurozus6, diyabetik retinopati7 gibi birçok kör edici göz hastalığına neden olur. Şimdiye kadar, bu hastalıkların çoğunun kesin patogenezi belirsizliğini korumaktadır. Sonuç olarak, RPE hücre biyolojisini, patolojik değişiklikleri ve altta yatan mekanizmaları incelemek için RPE hücre kültürü kurulmuştur.
Hücre biyolojisini incelemek için en basit model olarak, RPE hücrelerinin kültürü 1920’lerin8’i kadar erken bir tarihte başlatıldı. ARPE-19, RPE hücreleri olarak yaygın olarak kullanılmasına rağmen, pigmentasyon kaybı, parke taşı morfolojisi ve özellikle bu hücre hattındaki bariyer fonksiyonları birçok endişeyi gündeme getirmektedir9. Buna karşılık, birincil insan RPE hücrelerinin kültürü, fizyolojik ve patolojik çalışmalar için daha gerçekçi bir senaryo sunmaktadır9. Bununla birlikte, nispeten sınırlı kullanılabilirlik kullanımlarını kısıtlar ve etik sorunlar her zaman mevcuttur. Ek olarak, birkaç grup RPE hücrelerini kültürlemek için fare modellerini kullandı. Bununla birlikte, fare gözünün boyutu küçüktür ve tek bir kültür genellikle uygun olmayan birçok fare gerektirir9. Son zamanlarda, bilim adamları insan embriyonik kök hücrelerini kullanmak için yeni yöntemler geliştirdiler veya RPE hücrelerini türetmek için pluripotent kök hücreleri indüklediler. Bu teknik kalıtsal RPE bozukluklarının tedavisi için özel bir potansiyele sahip olmasına rağmen, zaman alıcıdır ve olgun RPE hücrelerinin üretilmesi genellikle birkaç ay gerektirir10. Bu sorunların üstesinden gelmek için, burada laboratuvarda rutin olarak yüksek saflıkta RPE hücrelerini izole etmek ve kültürlemek için takip edilmesi kolay bir protokol sunuyoruz. Uygun kültür koşulları altında, bu hücreler tipik RPE fonksiyonları gösterebilir ve tipik RPE morfolojileri sergileyebilir. Bu nedenle, bu kültür yöntemi RPE fizyolojisini anlamak, sitotoksisiteyi incelemek, ilgili oküler hastalıkların patolojik mekanizmalarını araştırmak ve ilaç taramaları yapmak için iyi bir model sağlayabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, RPE hücrelerinin domuz gözbebeklerinden izolasyonu, kültürü ve karakterizasyonu için ayrıntılı ve optimize edilmiş bir protokol, RPE hücrelerinin in vitro karakterizasyonu ve RPE ile ilişkili bozukluk çalışmaları için iyi bir model oluşturmaktadır. RPE’nin insan, fare ve sıçan gözlerinden izole edilmesi için yöntemler daha önce 23,24,25 olarak tanımlanmıştır. Bununla birlikte, bazı …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, bu çalışmada hücrelerine katkıda bulunan tüm hayvanlara şükranlarını ve saygılarını göstermek istemektedir. Bu çalışma kısmen Çin Ulusal Anahtar Ar-Ge Programı’ndan (2019YFA0111200, Yi Liao & Yuan Gao ve Hibe no. 2018YFA0107301, Wei Li) gelen hibelerle desteklenmiştir. Yazarlar, konfokal görüntülemede teknik destek için Xiamen Üniversitesi Central Lab, Tıp Fakültesi’nden Jingru Huang ve Xiang You’ya teşekkür ediyor.
Materials
| ARPE-19 cells | CCTCC | GDC0323 | |
| Bovine serum albumin | Yeasen | 36101ES60 | |
| Confocal microscopy | Zeiss | LSM 880 with Airyscan | |
| ChemiDoc Touch | Bio-Rad | 1708370 | |
| Cell scraper | Sangon | F619301 | |
| 10 cm culture dish | NEST | 121621EH01 | |
| 12-well culture plate | NEST | 29821075P | |
| DMEM F12 Medium | Gibco | C11330500BT | |
| DMEM basic Medium | Gibco | C11995500BT | |
| EVOM2 | World Precision Instruments | EVOM2 | For TER measurement |
| Fetal bovine serum | ExCell Bio | FSP500 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11034 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A-11012 | |
| Goat anti Mouse IgG (H/L):HRP | Bio-Rad | 0300-0108P | |
| Goat anti Rabbit IgG (H/L):HRP | Bio-Rad | 5196-2504 | |
| hydrocortisone | MCE | HY-N0583/CS-2226 | |
| Hoechst 33342 solution (20 mM) | ThermoFisher Scientific | 62249 | |
| LightCycler 96 Instrument | Roche | 5815916001 | |
| Liothyronine | MCE | HY-A0070A/CS-4141 | |
| laminin | Sigma-Aldrich | L2020-1MG | |
| MEM(1X)+GlutaMAX Medium | Gibco | 10566-016 | |
| MEM NEAA(100X) | Gibco | 11140-050 | |
| Millex-GP syringe filter unit | Millipore | SLGPR33RB | |
| N1 | Sigma-Aldrich | SLCF4683 | |
| NcmECL Ultra | New Cell&Molecular Biotech | P10300 | |
| Non-fat Powdered Milk | Solarbio | D8340 | |
| Nicotinamide | SparkJade | SJ-MV0061 | |
| Na+-K+ ATPase antibody | Abcam | ab76020 | Recognize both human and porcine proteins |
| PAGE Gel Fast Preparation Kit(10%) | Epizyme | PG112 | |
| primary Human RPE cells | – | – | Generous gift from Shoubi Wang lab |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| Prism | GraphPad by Dotmatics | version 8.0 | |
| Protease Inhibitor Cocktails | APExBIO | K1024 | |
| PRE65 antibody | Proteintech | 17939-1-AP | Recognize both human and porcine proteins |
| PEDF antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-390172 | Recognize both human and porcine proteins |
| 100 x penicillin/streptomycin | Biological Industries | 03-031-1BCS | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | RARBIO | RA-9005 | |
| ReverTra Ace qPCR RT Master Mix | Toyobo | FSQ-201 | |
| RIPA buffer | ThermoFisher Scientific | 89900 | |
| 15 mL sterile centrifuge tubes | NEST | 601052 | |
| 50 mL sterile centrifuge tubes | NEST | 602052 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| Taurine | Damas-beta | 107-35-7 | |
| Trizol | Thermo-Fisher | 15596026 | RNA extraction solution |
| TB Green Fast qPCR Mix | Takara | RR430A | |
| 12-well transwell inserts | Labselect | 14212 | |
| VEGF antibody | Proteintech | 19003-1-AP | Recognize both human and porcine proteins |
| VEGF ELISA kit | Novusbio | VAL106 | |
| ZO-1 antibody | ABclonal | A0659 | Recognize both human and porcine proteins |
References
- Tan, L. X., Germer, C. J., La Cunza, N., Lakkaraju, A. Complement activation, lipid metabolism, and mitochondrial injury: Converging pathways in age-related macular degeneration. Redox Biology. 37, 101781 (2020).
- Caceres, P. S., Rodriguez-Boulan, E. Retinal pigment epithelium polarity in health and blinding diseases. Current Opinion in Cell Biology. 62, 37-45 (2020).
- Lakkaraju, A., et al. The cell biology of the retinal pigment epithelium. Progress in Retinal and Eye Research. 78, 100846 (2020).
- Somasundaran, S., Constable, I. J., Mellough, C. B., Carvalho, L. S. Retinal pigment epithelium and age-related macular degeneration: A review of major disease mechanisms. Clinical & Experimental Ophthalmology. 48 (8), 1043-1056 (2020).
- Ducloyer, J. B., Le Meur, G., Cronin, T., Adjali, O., Weber, M. Gene therapy for retinitis pigmentosa. Medecine Sciences. 36 (6-7), 607-615 (2020).
- den Hollander, A. I., Roepman, R., Koenekoop, R. K., Cremers, F. P. Leber congenital amaurosis: genes, proteins and disease mechanisms. Progress in Retinal and Eye Research. 27 (4), 391-419 (2008).
- Samuels, I. S., Bell, B. A., Pereira, A., Saxon, J., Peachey, N. S. Early retinal pigment epithelium dysfunction is concomitant with hyperglycemia in mouse models of type 1 and type 2 diabetes. Journal of Neurophysiology. 113 (4), 1085-1099 (2015).
- Smith, D. T. Melanin pigment in the pigmented epithelium of the retina of the embryo chick eye studied in vivo and in vino. The Anatomical Record. 18, 260-261 (1920).
- Schnichels, S., et al. Retina in a dish: Cell cultures, retinal explants and animal models for common diseases of the retina. Progress in Retinal and Eye Research. 81, 100880 (2021).
- D’Antonio-Chronowska, A., D’Antonio, M., Frazer, K. A. In vitro differentiation of human iPSC-derived retinal pigment epithelium cells (iPSC-RPE). Bio-Protocol. 9 (24), 3469 (2019).
- Hazim, R. A., Volland, S., Yen, A., Burgess, B. L., Williams, D. S. Rapid differentiation of the human RPE cell line, ARPE-19, induced by nicotinamide. Experimental Eye Research. 179, 18-24 (2019).
- Dunn, K. C., Aotaki-Keen, A. E., Putkey, F. R., Hjelmeland, L. M. ARPE-19, a human retinal pigment epithelial cell line with differentiated properties. Experimental Eye Research. 62 (2), 155-169 (1996).
- . Scientific, T Available from: https://www.thermofisher.cn/document-connect/document (2022)
- . Toyota Available from: https://www.toyoboglobal.com/seihin/xr/likescience/support/manual/FSQ-201.pdf (2022)
- . Abcam Available from: https://www.abcam.cn/protocols/immunocytochemistry-immunofluorescence-protocol (2022)
- . Zeiss Available from: https://www.zeiss.com/microscopy/en/products/software/zeiss-zen-lite.html#manuals (2022)
- . Cell Signal Technology Available from: https://www.cellsignal.cn/learn-and-support/protocols/protocol-western (2022)
- Wang, S., et al. Reversed senescence of retinal pigment epithelial cell by coculture with embryonic stem cell via the TGFbeta and PI3K pathways. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 588050 (2020).
- Pfeffer, B. A., Philp, N. J. Cell culture of retinal pigment epithelium: Special Issue. Experimental Eye Research. 126, 1-4 (2014).
- Lehmann, G. L., Benedicto, I., Philp, N. J., Rodriguez-Boulan, E. Plasma membrane protein polarity and trafficking in RPE cells: past, present and future. Experimental Eye Research. 126, 5-15 (2014).
- Anderson, J. M., Van Itallie, C. M. Physiology and function of the tight junction. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (2), 002584 (2009).
- Nita, M., Strzalka-Mrozik, B., Grzybowski, A., Mazurek, U., Romaniuk, W. Age-related macular degeneration and changes in the extracellular matrix. Medical Science Monitor. 20, 1003-1016 (2014).
- Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells. Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).
- Langenfeld, A., Julien, S., Schraermeyer, U. An improved method for the isolation and culture of retinal pigment epithelial cells from adult rats. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 253 (9), 1493-1502 (2015).
- Sonoda, S. A protocol for the culture and differentiation of highly polarized human retinal pigment epithelial cells. Nature Protocols. 4 (5), 662-673 (2009).
