Salmonella invaderer og replikerer inde i tarmepitelceller både i salmonellaspecifikke vakuoler og fri i cytosolen (hyperreplikation). En høj-gennemstrømning fluorescens mikroskopi-baseret protokol er beskrevet her for at kvantificere de intracellulære fænotyper af Salmonella ved to komplementære billedanalyser gennem ImageJ, der når enkeltcelleopløsning og scoring.
Salmonella er et enterisk patogen, der er i stand til at invadere tarmepitelet og replikere i enterocytter, både inde i salmonellaspecifikke vakuoler og fri i cytosolen (cytosolisk hyperreplikation). Disse forskellige fænotyper af intracellulær replikation driver til forskellige veje for patogenese, dvs. cytosolisk hyperreplikation inducerer inflammatorisk celledød og ekstrudering i tarmens lumen, mens vakuolær replikation fører til transepitelpenetration og systemisk spredning. Der blev gjort en betydelig indsats for at skabe mikroskopiværktøjer til at studere salmonellas opførsel inde i invaderede celler, såsom pCHAR-Duo fluorescensreporterplasmid, der tillader diskrimination mellem vakuolære og cytosoliske bakterier ved differentiel ekspression af mCherry og GFP. Imidlertid scores intracellulære fænotyper ofte manuelt, en tidskrævende procedure, der begrænser analysen til et lille antal prøver og celler. For at overvinde disse begrænsninger blev der udviklet to komplementære og automatiserede billedanalyser ved hjælp af ImageJ, en frit tilgængelig billedanalysesoftware. I protokollen med høj kapacitet blev epitelceller inficeret med Salmonella, der bar pCHAR-Duo ved hjælp af 96-brøndplader. Billeddannelse blev udført ved hjælp af et automatiseret fluorescensmikroskop. Derefter blev to billedanalysemetoder anvendt til at måle salmonellas intracellulære opførsel på forskellige detaljeringsniveauer. Den første metode måler den samlede intracellulære bakteriebelastning og omfanget af cytosolisk hyperreplikation. Det er hurtigt og tillader scoring af et stort antal celler og prøver, hvilket gør det velegnet til assays med høj kapacitet såsom screeningseksperimenter. Den anden metode udfører enkeltcelleanalyse for at bestemme procentdelen af inficerede celler, den gennemsnitlige vakuolære belastning af Salmonella og den cytosoliske hyperreplikationshastighed, der giver større detaljer om Salmonella-adfærd inde i epitelceller. Protokollerne kan udføres af specielt designede ImageJ-scripts til automatisk at køre batchanalyser af de vigtigste trin i Salmonella-enterocyt-interaktion.
Salmonella er det hyppigst rapporterede bakteriemiddel, der forårsager udbrud af fødevarebårne sygdomme i Den Europæiske Union1. Den primære patologiske manifestation af Salmonella-infektion er enteritis, som er resultatet af patogenadfærden i tarmen efter indtagelse og den deraf følgende lokale inflammatoriske respons2. Salmonella kan dog også spredes til ekstra-tarmsteder og forårsage systemisk infektion, især hos immunkompromitterede individer. Typen af interaktion mellem Salmonella og tarmepitelet betinger resultatet af infektionen. En gang i tarmens lumen invaderer og replikerer Salmonella inde i tarmepitelceller. På intracellulært niveau kan Salmonella præsentere to forskellige replikationsfænotyper, den cytosoliske hyperreplikation og den intravacuolære langsomme replikation inden for salmonellaholdige vakuoler (SCV’er). Den cytosoliske hyperreplikation inducerer inflammatorisk værtscelledød og Salmonella-ekstrudering i tarmens lumen3; den vakuolære replikation fører til en transepitelpenetration og systemisk spredning4. Derfor påvirker omfanget af invasion og vakuolær vs. cytosolisk replikation infektionsforløbet.
Slægten Salmonella er meget forskelligartet, herunder tusindvis af serotyper med forskellige værtsområder og evner til at forårsage sygdom. For eksempel S. Typhimurium er defineret som en generalist serovar, fordi det inficerer flere uafhængige værter, og repræsenterer en af hovedårsagerne til human salmonellose. Anderledes, S. Derby betragtes som en svinetilpasset serovar, da den for det meste er isoleret fra svinet, men det rapporteres også i top fem af serovarerne, der er ansvarlige for human infektion1. Imidlertid er viden om den bakterielle adfærd inde i epitelcellerne i det væsentlige begrænset til undersøgelsen af nogle få referencestammer, som S. Typhimurium SL1344, der ikke repræsenterer den store naturlige mangfoldighed af Salmonella patogenicitet. Karakterisering af samspillet mellem forskellige stammer af Salmonella med epitelceller ville bidrage til at forstå deres forskellige patogenicitet. Af denne grund blev der udviklet en mikroskopibaseret protokol med høj kapacitet til at analysere den intracellulære opførsel af et stort antal stammer på en hurtig og stort set automatiseret måde. I denne protokol blev infektion af epitelceller udført i 96-brønds billeddannelsesplader, og billedoptagelse blev foretaget ved hjælp af et automatiseret fluorescensmikroskop. pCHAR-Duo-plasmidet blev brugt til at observere invasions- og replikationsfænotyperne af Salmonella inde i epitelceller gennem fluorescerende mikroskopi5. Dette plasmid bærer genet, der koder for den røde fluorescerende reporter mCherry, konstitutivt udtrykt af alle de transformerede bakterieceller, og genet, der koder for den grønne fluorescerende reporter GFP, hvis ekspression aktiveres af glucose-6-phosphat, der udelukkende er til stede i cytosolen af eukaryote celler og fraværende i SCV’er. Derfor tillader plasmidet diskrimination mellem vakuolære og cytosoliske bakterier ved differentiel ekspression af mCherry- og GFP-journalister.
De vakuolære og cytosoliske bakterier på mikroskopibilleder kvantificeres almindeligvis ved manuel scoring6, men dette er en tidskrævende metode, der begrænser analysen til et lille antal prøver. Derfor blev to komplementære og automatiserede billedanalyser udviklet områdeanalyse og enkeltcelleanalyse ved hjælp af ImageJ7, en frit tilgængelig billedanalysesoftware. Områdeanalysen måler den samlede intracellulære bakteriebelastning og omfanget af cytosolisk hyperreplikation ved hjælp af data fra områder optaget af epitelceller, røde og grønne salmonellaer i hvert erhvervet mikroskopibillede. Denne metode kan anvendes på billeder erhvervet ved lav forstørrelse; Derfor giver det mulighed for at score et stort antal epitelceller med få billeder, hvilket forkorter erhvervelsestiden. Enkeltcelleanalysen bruger cellesegmentering til at bestemme procentdelen af inficerede celler, den gennemsnitlige vakuolære belastning og procentdelen af inficerede celler, der gennemgår cytosolisk hyperreplikation med enkeltcelleopløsning.
I denne protokol er alle trin i billedanalysen beskrevet detaljeret, der skal udføres manuelt, men den samme analyse kan automatiseres af vores specielt designede ImageJ-scripts. Disse scripts giver også mulighed for at køre batchanalyser for automatisk at analysere flere billeder og dermed fremskynde udførelsen af metoden.
Den måde, hvorpå Salmonella koloniserer tarmepitelceller, påvirker infektionsresultatet. Ved invasion inducerer den cytosoliske hyperreplikation betændelse i tarmen3, mens vakuolær replikation kan føre til systemisk spredning4. Salmonellastammer kan variere i deres evne til at invadere og replikere inde i tarmepitelceller9. Faktisk er Salmonella en ekstremt forskelligartet slægt, der omfatter mere end 2.500 serovarer, som har forskellige evner til at forårsage sygdom. Desuden er salmonella den hyppigst rapporterede årsag til fødevarebårne udbrud i EU, hvilket tyder på en stor spredning i den menneskelige befolkning1. Derfor er tilgængeligheden af pålidelige metoder med høj kapacitet til kvantificering af de intracellulære fænotyper af Salmonella af stor betydning for at evaluere forskelle i virulens blandt et stort antal Salmonella-stammer og i sidste ende muliggøre en nøjagtig og belastningsspecifik risikovurdering af dette patogen.
Protokollen beskrevet her måler salmonellaens opførsel inde i epitelceller på en hurtig og automatiseret måde. Infektionen af epitelceller udføres i 96-brønds billeddannende mikroplader, og et automatiseret fluorescensmikroskop bruges til billedoptagelse, hvilket gør protokollen velegnet til applikationer med høj kapacitet. Denne protokol udnytter pCHAR-Duo-plasmidet, som gør det muligt at skelne vakuolær fra cytosolisk salmonella gennem differentialekspressionen af to fluorescerende journalister5. De intracellulære fænotyper af Salmonella analyseres ofte ved manuel scoring, en tidskrævende procedure, der er uegnet til analyse af et stort antal stammer og cellekulturer pr. stamme og tilbøjelig til operatørfejl og variation mellem operatører. For at overvinde disse begrænsninger blev der udviklet to komplementære og automatiserede billedanalyser, områdeanalysen og enkeltcelleanalysen. ImageJ, en frit tilgængelig software, blev brugt til at udvikle de to analyser. For at fremskynde protokoludførelsen leveres ImageJ-scripts til batchanalyse af flere anskaffelsesfiler uden operatørintervention som supplerende filer.
Områdeanalysen var designet til i nogle få trin at kvantificere den samlede kolonisering af epitelceller (infektionsforhold) og hyperreplikationsniveauet (hyperreplikationsforhold) gennem måling af de områder, der specifikt er optaget af kernerne i epitelceller og ved salmonella, der udtrykker enten mCherry eller mCherry sammen med GFP. Områdeanalysen anvendes på billeder erhvervet ved lav forstørrelse, hvor både vakuolære og hyperreplikerende salmonellaer er i fokus i samme z-plan, og et stort antal epitelceller vises pr. mikroskopisk felt, hvilket reducerer størrelsen og antallet af anskaffelsesfiler. Områdeanalysen giver mulighed for en automatiseret, hurtig og beregningsmæssig lysanalyse af et stort antal prøver, hvilket gør den velegnet til assays med høj kapacitet såsom screeningseksperimenter.
Enkeltcelleanalysen blev designet til at kvantificere Salmonella-fænotyper inde i epitelceller med enkeltcelleopløsning, opnået gennem cellesegmentering og måling af det cellulære område og procentdelen af arealet optaget af vakuolær og cytosolisk hyperreplikerende Salmonellae. Den samlede kolonisering af epitelceller, der er karakteriseret gennem områdeanalysen, er her opdelt i tre kvantitative parametre, procentdelen af inficerede celler, den gennemsnitlige vakuolære belastning og hyperreplikationshastigheden, hvilket gør det muligt at evaluere og kvantificere hver fænotypes bidrag til den samlede kolonisering og supplerer derfor resultaterne af områdeanalysen. De større detaljer, der tilbydes af enkeltcelleanalysen, kommer på bekostning af langsommere billedoptagelse og analyse. For at opnå enkeltcelleopløsning udføres billedoptagelse faktisk ved høj forstørrelse. Dette indebærer, at der er behov for flere z-planer for at observere både vakuolære og cytosoliske salmonellaer i fokus, og at erhvervelsen af et stort antal felter pr. prøve er nødvendig for at score et stort antal epitelceller og dermed forlænge erhvervelsestiden i sammenligning med områdeanalyse. Desuden er analysen af flere store anskaffelsesfiler beregningskrævende og kræver derfor en passende arbejdsstation (en 6-core, 32 GB RAM-arbejdsstation blev brugt). Derfor kan enkeltcelleanalyse bruges som en selvstændig i begrænsede gennemstrømningsforhold eller som en anden niveau metode koblet til områdeanalysen for at få en dybere forståelse af Salmonella-fænotyperne inde i epitelceller.
De to komplementære analyser blev valideret ved hjælp af S. Tm, S. Derby wt, og S. Derby ΔsipA, valgt, fordi deres adfærd inde i epitelceller allerede var kendt for at afvige med hensyn til invasion eller replikation 9,10. Resultaterne af område- og enkeltcelleanalyserne viser, at protokollen tillod kvantitativt at skelne forskelle i intracellulære Salmonella-fænotyper i overensstemmelse med de testede stammers egenskaber. Desuden viser disse resultater, at enkeltcelleanalysen muliggør kvantificering af bidraget fra hver intracellulær fænotype (invasion, vakuolær belastning og cytosolisk replikation) til den samlede kolonisering scoret ved hjælp af områdeanalysen.
Denne protokol blev anvendt her til at studere in vitro patogenicitet af forskellige stammer af Salmonella, men den kan have andre anvendelser såsom undersøgelse af tilfældige mutanter til at identificere gener involveret i invasionen og / eller replikationen inde i epitelceller. Derudover kan protokollen tilpasses til at analysere salmonellas opførsel inde i andre cellelinjer end INT407-celler. Det kan også bruges som udgangspunkt for at udvikle lignende metoder til at studere cellepatogeninteraktion mellem andre intracellulære mikroorganismer.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne takke Dr. Olivia Steele-Mortimer for at dele pCHAR-Duo plasmid. Dette arbejde blev finansieret af det italienske sundhedsministerium, tilskud PRC2019014 og PRC2021004.
96-well imaging microplate | Eppendorf | 30741030 | Cell culture and infection |
Ampicillin | Sigma-Aldrich | 59349 | Bacteria culture |
Axio observer inverted microscope | ZEISS | Automated fluorescence microscope | |
Axiocam 305 Mono | ZEISS | Microscope Camera | |
Breathable sealing membrane | Sigma-Aldrich | Z380059 | Infection assay |
Colibrì 5/7 | ZEISS | Led light source | |
Collagen I rat tail | Life Technologies | A1048301 | Collagen coating |
DAPI | Invitrogen | D3571 | Cell staining |
Fetal bovine serum | Gibco | 10099-141 | Cell culture and infection |
Gentamicin | Sigma-Aldrich | G12664 | Infection assay |
Glacial acetic acid | Carlo Erba | 401391 | Collagen coating |
HCS CellMask Blue | Invitrogen | H32720 | Cell staining |
ImageJ | National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation (LOCI, University of Wisconsin) | Image processing software | |
Minimum Essential Eagle's Medium | Sigma-Aldrich | M5650-500ML | Cell culture and infection |
Paraformaldehyde 4% | Invitrogen | FB002 | Cell fixation |
Potassium chloride | PanReac AppliChem | 131494.1211 | PBS preparation |
Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | 60220 | PBS preparation |
Sodium Chloride | PanReac AppliChem | 131659.1214 | Bacteria culture and PBS preparation |
Sodium phosphate Dibasic | Sigma-Aldrich | 71640 | PBS preparation |
Tissue Culture Flask 25 cm2 plug seal screw cap | Euroclone | ET7025 | Cell culture |
Triton X-100 | Biorad | 1610407 | Cell staining |
Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200056 | Cell culture and infection |
Tryptone | Oxoid | LP0042B | Bacteria culture |
Yeast extract | Biolife | 4122202 | Bacteria culture |