이 프로토콜은 온전한 대두 결절로부터 진핵 폴리솜 정제를 위한 방법을 기술한다. 시퀀싱 후, 유전자 발현 분석을 위한 표준 파이프라인을 사용하여 전사체 및 트랜스라톰 수준에서 차등적으로 발현된 유전자를 식별할 수 있습니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
이 프로토콜의 목적은 대두의 진핵생물 번역(Glycine max) 공생 결절을 연구하기 위한 전략을 제공하는 것입니다. 이 논문은 RNA 시퀀싱을 사용하여 분석할 식물 유래 폴리리보솜 및 관련 mRNA를 분리하는 데 최적화된 방법을 설명합니다. 첫째, 세포질 용해물은 전체 냉동 대두 결절로부터 폴리솜 및 RNA 보존 조건에서 균질화를 통해 얻어진다. 그런 다음 저속 원심분리에 의해 용해물을 제거하고 상청액의 15%를 총 RNA(TOTAL) 분리에 사용합니다. 나머지 투명화된 용해물은 2층 슈크로스 쿠션(12% 및 33.5%)을 통한 초원심분리에 의해 폴리좀을 분리하는 데 사용됩니다. 폴리솜 관련 mRNA (PAR)는 재현탁 후 폴리솜 펠릿으로부터 정제된다. TOTAL과 PAR은 모두 RNA-seq에 대한 시퀀싱 라이브러리의 품질 표준을 충족하기 위해 고감도 모세관 전기영동으로 평가됩니다. 다운스트림 적용의 예로서, 시퀀싱 후, 유전자 발현 분석을 위한 표준 파이프라인을 사용하여 전사체 및 트랜스플라톰 수준에서 차등적으로 발현된 유전자를 수득할 수 있다. 요약하면,이 방법은 RNA-seq와 함께 공생 결절과 같은 복잡한 조직에서 진핵 mRNA의 번역 조절을 연구 할 수있게합니다.
서론
콩 (Glycine max)과 같은 콩과 식물은 뿌리 줄기라고하는 특정 토양 박테리아와 공생 할 수 있습니다. 이 상호 주의적 관계는 식물 뿌리에 새로운 기관인 공생 결절의 형성을 유도합니다. 결절은 박테리아를 숙주하는 식물 기관이며 세포질이 박테로이드라는 특수한 형태의 뿌리 줄기로 식민지화 된 숙주 세포로 구성됩니다. 이 박테로이드는 대기 질소 (N 2)의 암모니아로의 환원을 촉매하며, 암모니아는 탄수화물 1,2에 대한 대가로 식물로 옮겨집니다.
이 질소 고정 공생은 가장 잘 연구 된 식물-미생물 공생 중 하나이지만, 다양한 비 생물 적 스트레스 조건을받는 식물이 공생 파트너와의 상호 작용을 조절하는 방법과 이것이 결절 대사에 미치는 영향과 같은 많은 측면이 더 잘 이해되어야합니다. 이러한 과정은 결절 번역체 (즉, 활발히 번역 된 메신저 RNA [mRNA]의 하위 집합)를 분석함으로써 더 잘 이해 될 수있다. 폴리리보솜 또는 폴리솜은 mRNA와 관련된 여러 리보솜의 복합체로, 일반적으로 번역3을 연구하는 데 사용됩니다. 폴리솜 프로파일링 방법은 폴리솜과 관련....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
1. 식물 생장 및 뿌리 줄기 접종
- 필요한 결절을 생성하려면 통제 된 조건에서 성장 챔버에서 선택한 기질에 선택한 대두 종자를 뿌립니다.
참고 :이 프로토콜에서 씨앗은 모래 : 질석 (1 : 1)의 혼합물로 채워진 0.5L 플라스틱 병에 뿌려졌습니다. 성장 챔버는 각각 28°C/20°C의 주야간 사이클 온도 및 각각 16h/8h의 명암/어둠 광주기로 설정되었습니다. 광합성 활성 방사선 강도는 620 μmol·m−2·s−1이었다. - 액체 효모 추출물 만니톨 (YEM) 배지를 미리 준비하십시오 ( 재료 표 참조). 매체를 오토 클레이브하십시오.
- 종자 파종 당일에 100mL의 YEM이 들어있는 플라스크 1 개에 Bradyrhizobium elkanii U1302 균주를 접종합니다. 플라스크를 28°C에서 100 rpm의 오비탈 쉐이커 상에서 인큐베이션한다.
- 뿌리 줄기를 2 일 동안 자라게하고 묘목에 2mL의 배양 물을 접종하십시오.
2. 물 부족 처리 (선택 사항)
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
RNA 시퀀싱과 같은 대부분의 다운스트림 응용 분야에서 고품질 샘플이 라이브러리 준비 및 시퀀싱의 기본이기 때문에 위에서 언급한 절차로 정제된 TOTAL 및 PAR 분획의 양 및 품질 평가는 성공 여부를 결정하는 데 중요합니다. 더욱이, RNA 분자의 완전성은 샘플 수집순간 (18)에서 유전자 발현 프로파일의 스냅 샷의 캡처를 허용한다. 이러한 맥락에서 RNA 무결성 번호(RIN)는 바이오분석기를 사용하여 이러한 측정을 수행할 때 얻어집니다. RIN은 10(온전)에서 1(완전 저하)18 범위의 강력하고 안정적이며 사용자 독립적인 방식으로 무결성 값을 할당하는 데 사용됩니다.
그림 2A, B 는 여러 TOTAL 및 PAR 샘플 분획에 대한 고감도 모세관 전기 영동 시스템 (Bioanalyzer)의 표준 출력을 보여.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
번역 수준에서 유전자 발현 조절을 연구하는 것은 세포 유전자 발현의 종말점이 단백질 풍부도이기 때문에 다양한 생물학적 과정을 더 잘 이해하는 데 중요합니다13,14. 이것은 다염색체 분획을 정제해야하는 관심 조직 또는 유기체의 트랜스 라톰을 분석하고 관련 mRNA를 분석 한 3,4,34,35,36을 분석하여 평가할 수 있습니다.
자당 쿠션을 통해 대두 공생 결절 폴리솜을 정제한 다음 TOTAL 및 PAR 추출을 수행하는 방법이 여기에 제시됩니다. 두 RNA 분획을 모두 얻는 것은 RNA-.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자는 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 CSIC I+D 2020 보조금 번호 282, FVF 2017 보조금 번호 210 및 PEDECIBA(마리아 마사 사인즈)의 자금 지원을 받았습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 식물 생장 및 rhizobia 접종 | |||
| Orbital shaker | Daihan Scientific | Model SHO-1D | |
| YEM-medium | Amresco | J850 (효모 추출물) 0122 (만니톨) | |
| 수분 결핍 치료< / strong> | |||
| KNO3 | Merck | ||
| 포로미터 | 십각형 장치 | 모델 SC-1 | |
| 메스 | |||
| <강>세포질 추출물 준비 | |||
| Brij L23 | 시그마-알드리치 | P1254 | |
| 원심분리기 | 시그마 | 모델 2K15 | |
| 클로란페니콜 | 시그마-알드리치 | C0378 | |
| 시클로헥시미드 | 시그마-알드리치 | C7698 | |
| DOC | 시그마-알드리치 | 30970 | |
| DTT | 시그마-알드리치 | D9779 | |
| EGTA | 시그마-알드리치 | E3889 | |
| 이그팔 CA 360 | 시그마-알드리치 | I8896 | |
| KCl | 머크 | 1.04936 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| 플라스틱 티슈 그라인더 | Fisher Scientific | 12649595 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| PTE | Sigma-Aldrich | P2393 | |
| Tris | Invitrogen | 15504-020 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| 계량 접시 | Deltalab | 1911103 | |
| Preparation of sucrose cushions | |||
| Sucrose | Invitrogen | 15503022 | |
| SW 40 Ti rotor | Beckman-Coulter | ||
| Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | Optima L-100K | |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman-Coulter | 344059 | 13.2 mL 튜브 |
| RNA 추출 및 품질 관리 | |||
| Agarose | Thermo scientific | R0492 | |
| 바이오분석기 | 애질런트 | 모델 2100. 진핵생물 총 RNA 나노 분석 | |
| 클로로포 | DI | 41191 | |
| 에탄올 | Dorwil | UN1170 | |
| 이소프로판올 | Mallinckrodt | 3032-06 | |
| 글리코겐 | 시그마 | 10814-010 | |
| TRIzol LS | Ambion | 102960028 | |
| Miscellaneous | |||
| Falcon 튜브 15 mL | Biologix | 10-0152 | |
| 필터 팁 10 &마이크로; L | BioPointe Scientific | 321-4050 | |
| 필터 팁 1000 &마이크로; L | BioPointe Scientific | 361-1050 | |
| 필터 팁 20 &마이크로; L | BioPointe Scientific | 341-4050 | |
| 필터 팁 200 &마이크로; L | Tarsons | 528104 | |
| 마이크로 원심분리기 튜브 1.5 mL | Tarsons | 500010-N | |
| 마이크로 원심분리기 튜브 2.0 mL | Tarsons | 500020-N | |
| 염기서열분석 회사 | Macrogen | ||
| Sterile 250 mL 플라스크 | Marienfeld | 4110207 |
참고문헌
- Limpens, E., et al. Cell- and tissue-specific transcriptome analyses of Medicago truncatula root nodules. PLoS ONE. 8 (5), 64377(2013).
- Masson-Boivin, C., Giraud, E., Perret, X., Batut, J. Establishing nitrogen-fixing symbiosis with legu....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
