Summary

Purificación de polisomas a partir de nódulos simbióticos de soja

Published: July 01, 2022
doi:

Summary

Este protocolo describe un método para la purificación de polisomas eucariotas a partir de nódulos de soja intactos. Después de la secuenciación, se pueden utilizar tuberías estándar para el análisis de la expresión génica para identificar genes expresados diferencialmente a nivel de transcriptoma y translatomo.

Abstract

El objetivo de este protocolo es proporcionar una estrategia para estudiar el translatomo eucariota del nódulo simbiótico de soja (Glycine max). Este documento describe métodos optimizados para aislar polirribosomas derivados de plantas y sus ARNm asociados para ser analizados mediante secuenciación de ARN. En primer lugar, los lisados citoplasmáticos se obtienen mediante homogeneización en condiciones de preservación de polisomas y ARN a partir de nódulos de soja enteros congelados. Luego, los lisados se eliminan por centrifugación a baja velocidad, y el 15% del sobrenadante se usa para el aislamiento de ARN total (TOTAL). El lisado eliminado restante se utiliza para aislar polisomas por ultracentrifugación a través de un cojín de sacarosa de dos capas (12% y 33,5%). El ARNm asociado a polisomas (PAR) se purifica a partir de gránulos polisomales después de la resuspensión. Tanto TOTAL como PAR se evalúan mediante electroforesis capilar altamente sensible para cumplir con los estándares de calidad de las bibliotecas de secuenciación para RNA-seq. Como ejemplo de una aplicación posterior, después de la secuenciación, se pueden utilizar tuberías estándar para el análisis de la expresión génica para obtener genes expresados diferencialmente a nivel de transcriptoma y translatomo. En resumen, este método, en combinación con RNA-seq, permite estudiar la regulación traslacional de los ARNm eucariotas en un tejido complejo como es el nódulo simbiótico.

Introduction

Las plantas leguminosas, como la soja (Glycine max), pueden establecer simbiosis con bacterias específicas del suelo llamadas rizobios. Esta relación mutualista provoca la formación de nuevos órganos, los nódulos simbióticos, en las raíces de las plantas. Los nódulos son los órganos de la planta que albergan las bacterias y consisten en células huésped cuyo citoplasma está colonizado con una forma especializada de rizobios llamados bacteroides. Estos bacteroides catalizan la reducción del nitrógeno atmosférico (N2) en amoníaco, que se transfiere a la planta a cambio de carbohidratos 1,2.

Aunque esta simbiosis fijadora de nitrógeno es una de las simbiosis planta-microbio mejor estudiadas, quedan muchos aspectos por comprender mejor, como cómo las plantas sometidas a diferentes condiciones de estrés abiótico modulan su interacción con su pareja simbiótica y cómo esto afecta el metabolismo de los nódulos. Estos procesos podrían entenderse mejor analizando el translatomo de nódulos (es decir, el subconjunto de ARN mensajeros [ARNm] traducidos activamente). Los polirribosomas o polisomas son complejos de múltiples ribosomas asociados con el ARNm, comúnmente utilizados para estudiar la traducción3. El método de perfilado de polisomas consiste en el análisis de los ARNm asociados a polisomas y ha sido utilizado con éxito para estudiar los mecanismos posttranscripcionales que controlan la expresión génica que ocurre en diversos procesos biológicos 4,5.

Históricamente, el análisis de expresión del genoma se ha centrado principalmente en determinar la abundancia de ARNm 6,7,8,9. Sin embargo, existe una falta de correlación entre la transcripción y los niveles de proteínas debido a las diferentes etapas de la regulación posttranscripcional de la expresión génica, particularmente la traducción10,11,12. Además, no se ha observado dependencia entre los cambios a nivel del transcriptoma y los que ocurren a nivel del translatomo13. El análisis directo del conjunto de ARNm que se están traduciendo permite una medición más precisa y completa de la expresión génica celular (cuyo punto final es la abundancia de proteínas) que la obtenida cuando sólo se analizan los niveles de ARNm14,15,16.

Este protocolo describe cómo los polisomas derivados de plantas se purifican a partir de nódulos de soja intactos mediante centrifugación diferencial a través de un cojín de sacarosa de dos capas (Figura 1). Sin embargo, dado que los ribosomas derivados de bacteroides también están presentes en los nódulos, se purifica una mezcla de ribosomas y especies de ARN, aunque los eucariotas representan la fracción principal (90%-95%). También se describe el posterior aislamiento, cuantificación y control de calidad del ARN (Figura 1). Este protocolo, en combinación con RNA-seq, debería proporcionar resultados experimentales sobre la regulación traslacional de los ARNm eucariotas en un tejido complejo como el nódulo simbiótico.

Figure 1
Figura 1: Resumen esquemático de la metodología propuesta para la purificación de polisomas eucariotas a partir de nódulos simbióticos. El esquema ofrece una visión general de los pasos seguidos en el protocolo desde (1) crecimiento de plantas y (2) recolección de nódulos hasta (3) preparación de los extractos citosólicos, (3) obtención de muestras TOTAL y (4) muestras PAR, y (5) extracción de ARN y control de calidad. Abreviaturas: PEB = tampón de extracción de polisomas; RB = tampón de resuspensión; TOTAL = ARN total; PAR = ARNm asociado a polisomas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Protocol

1. Crecimiento de plantas e inoculación de rizobios Para generar los nódulos requeridos, siembre las semillas de soja de elección en el sustrato seleccionado en una cámara de crecimiento bajo condiciones controladas.NOTA: En este protocolo, las semillas se sembraron en una botella de plástico de 0,5 L llena de una mezcla de arena: vermiculita (1:1). La cámara de crecimiento se estableció con una temperatura de ciclo día/noche de 28 °C / 20 °C, respectivamente, y un fotoperíodo de…

Representative Results

La evaluación de la cantidad y calidad de las fracciones TOTAL y PAR purificadas con el procedimiento mencionado anteriormente es clave para determinar su éxito, ya que para la mayoría de las aplicaciones posteriores, como la secuenciación de ARN, las muestras de alta calidad son fundamentales para la preparación y secuenciación de bibliotecas. Además, la integridad de las moléculas de ARN permite la captura de una instantánea del perfil de expresión génica en el momento de la recolección de la muestra<sup cl…

Discussion

El estudio de la regulación de la expresión génica a nivel traslacional es fundamental para comprender mejor los diferentes procesos biológicos, ya que el punto final de la expresión génica celular es la abundancia de proteínas13,14. Esto se puede evaluar analizando el translatomo del tejido u organismo de interés para el cual se debe purificar la fracción polisomal y analizar sus ARNm asociados 3,4,34,35,36.<sup class=…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Esta investigación ha sido financiada por la subvención I+D 2020 del CSIC nº 282, la subvención FVF 2017 nº 210 y PEDECIBA (María Martha Sainz).

Materials

Plant growth and rhizobia inoculation
Orbital shaker Daihan Scientific Model SHO-1D
YEM-medium Amresco J850 (yeast extract) 0122 (mannitol)
Water deficit treatment
KNO3 Merck 221295
Porometer Decagon Device Model SC-1
Scalpel
Preparation of cytosolic extracts
Brij L23 Sigma-Aldrich P1254
Centrifuge Sigma Model 2K15
Chloranphenicol Sigma-Aldrich C0378
Cycloheximide Sigma-Aldrich C7698
DOC Sigma-Aldrich 30970
DTT Sigma-Aldrich D9779
EGTA Sigma-Aldrich E3889
Igepal CA 360 Sigma-Aldrich I8896
KCl Merck 1.04936
MgCl2 Sigma-Aldrich M8266
Plastic tissue grinder Fisher Scientific 12649595
PMSF Sigma-Aldrich P7626
PTE Sigma-Aldrich P2393
Tris Invitrogen 15504-020
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787
Tween 20 Sigma-Aldrich P1379
Weighing dish  Deltalab 1911103
Preparation of sucrose cushions
Sucrose Invitrogen 15503022
SW 40 Ti rotor Beckman-Coulter
Ultracentrifuge Beckman-Coulter Optima L-100K
Ultracentrifuge tubes Beckman-Coulter 344059 13.2 mL tubes
RNA extraction and quality control
Agarose Thermo scientific R0492
Bioanalyzer Agilent Model 2100. Eukaryote total RNA nano assay
Chloroform DI 41191
Ethanol Dorwil UN1170
Isopropanol Mallinckrodt 3032-06
Glycogen Sigma 10814-010
TRIzol LS Ambion 102960028
Miscellaneous
Falcon tubes 15 mL Biologix 10-0152
Filter tips 10 µL BioPointe Scientific 321-4050
Filter tips 1000 µL BioPointe Scientific 361-1050
Filter tips 20 µL BioPointe Scientific 341-4050
Filter tips 200 µL Tarsons 528104
Microcentrifuge tubes 1.5 mL Tarsons 500010-N
Microcentrifuge tubes 2.0 mL Tarsons 500020-N
Sequencing company Macrogen
Sterile 250 mL flask Marienfeld 4110207

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Sainz, M. M., Filippi, C. V., Eastman, G., Sotelo-Silveira, M., Martinez, C. M., Borsani, O., Sotelo-Silveira, J. Polysome Purification from Soybean Symbiotic Nodules. J. Vis. Exp. (185), e64269, doi:10.3791/64269 (2022).

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