Denne protokol beskriver en metode til eukaryot polysomrensning fra intakte sojabønneknuder. Efter sekventering kan standardrørledninger til genekspressionsanalyse bruges til at identificere differentielt udtrykte gener på transkriptom- og translatomniveauerne.
Formålet med denne protokol er at tilvejebringe en strategi til undersøgelse af det eukaryote translatom af sojabønnen (Glycine max) symbiotisk knude. Dette papir beskriver metoder optimeret til at isolere planteafledte polyribosomer og deres tilknyttede mRNA’er, der skal analyseres ved hjælp af RNA-sekventering. For det første opnås cytoplasmatiske lysater gennem homogenisering i polysom- og RNA-bevarende betingelser fra hele, frosne sojabønneknuder. Derefter ryddes lysater ved centrifugering ved lav hastighed, og 15% af supernatanten anvendes til total RNA (TOTAL) isolering. Det resterende ryddede lysat bruges til at isolere polysomer ved ultracentrifugering gennem en tolags saccharosepude (12% og 33,5%). Polysom-associeret mRNA (PAR) renses fra polysomale pellets efter resuspension. Både TOTAL og PAR evalueres ved meget følsom kapillærelektroforese for at opfylde kvalitetsstandarderne for sekventeringsbiblioteker for RNA-seq. Som et eksempel på en downstream-applikation kan standardrørledninger til genekspressionsanalyse efter sekventering anvendes til at opnå differentielt udtrykte gener på transkriptom- og translatomniveauerne. Sammenfattende tillader denne metode i kombination med RNA-seq undersøgelsen af den translationelle regulering af eukaryote mRNA’er i et komplekst væv såsom den symbiotiske knude.
Bælgplanter, såsom sojabønner (Glycine max), kan etablere symbiose med specifikke jordbakterier kaldet rhizobia. Dette mutualistiske forhold fremkalder dannelsen af nye organer, de symbiotiske knuder, på plantens rødder. Knuderne er planteorganerne, der er vært for bakterierne og består af værtsceller, hvis cytoplasma koloniseres med en specialiseret form for rhizobia kaldet bakterioider. Disse bakteroider katalyserer reduktionen af atmosfærisk nitrogen (N2) til ammoniak, som overføres til planten til gengæld for kulhydrater 1,2.
Selvom denne kvælstoffikserende symbiose er en af de mest velundersøgte plantemikrobesymbioser, er der stadig mange aspekter, der skal forstås bedre, såsom hvordan planter, der udsættes for forskellige abiotiske stressforhold, modulerer deres interaktion med deres symbiotiske partner, og hvordan dette påvirker knudemetabolismen. Disse processer kunne bedre forstås ved at analysere knudetranslatomet (dvs. delmængden af messenger RNA’er [mRNA’er] aktivt oversat). Polyribosomer eller polysomer er komplekser af flere ribosomer forbundet med mRNA, der almindeligvis anvendes til at studere oversættelse3. Polysomprofileringsmetoden består af analysen af mRNA’erne forbundet med polysomer og er med succes blevet brugt til at studere de posttranskriptionelle mekanismer, der styrer genekspression, der forekommer i forskellige biologiske processer 4,5.
Historisk set har genomekspressionsanalyse primært fokuseret på at bestemme mRNA-overflod 6,7,8,9. Der er imidlertid en mangel på korrelation mellem transkription og proteinniveauer på grund af de forskellige stadier af posttranskriptionel regulering af genekspression, især translation10,11,12. Desuden er der ikke observeret nogen afhængighed mellem ændringerne på transkriptomniveauet og dem, der forekommer på translatomniveau13. Den direkte analyse af det sæt mRNA’er, der oversættes, muliggør en mere nøjagtig og komplet måling af cellegenekspressionen (hvis endepunkt er proteinoverflod) end den, der opnås, når kun mRNA-niveauer analyseres14,15,16.
Denne protokol beskriver, hvordan planteafledte polysomer renses fra intakte sojabønneknuder ved differentiel centrifugering gennem en tolags saccharosepude (figur 1). Men da bakteroidafledte ribosomer også er til stede i knuderne, renses en blanding af ribosomer og RNA-arter, selvom de eukaryote repræsenterer hovedfraktionen (90% -95%). Den efterfølgende RNA-isolering, kvantificering og kvalitetskontrol er også beskrevet (figur 1). Denne protokol skal i kombination med RNA-seq give eksperimentelle resultater om translationel regulering af eukaryote mRNA’er i et komplekst væv, såsom den symbiotiske knude.
Figur 1: Skematisk oversigt over den foreslåede metode til eukaryot polysomrensning fra symbiotiske knuder. Ordningen giver et overblik over de trin, der følges i protokollen fra (1) plantevækst og (2) knudehøst til (3) forberedelse af cytosolekstrakter, (3) opnåelse af TOTAL-prøver og (4) PAR-prøver og (5) RNA-ekstraktion og kvalitetskontrol. Forkortelser: PEB = polysomekstraktionsbuffer; RB = resuspension buffer; TOTAL = total RNA; PAR = polysom-associeret mRNA. Klik her for at se en større version af denne figur.
At studere genekspressionsregulering på translationelt niveau er afgørende for bedre at forstå forskellige biologiske processer, da endepunktet for cellegenekspression er proteinmængde13,14. Dette kan vurderes ved at analysere translatomet af vævet eller organismen af interesse, for hvilket den polysomale fraktion skal oprenses, og dets associerede mRNA’er analyseres 3,4,34,35,36.<sup clas…
The authors have nothing to disclose.
Denne forskning blev finansieret af CSIC I + D 2020-bevilling nr. 282, FVF 2017-bevilling nr. 210 og PEDECIBA (María Martha Sainz).
Plant growth and rhizobia inoculation | |||
Orbital shaker | Daihan Scientific | Model SHO-1D | |
YEM-medium | Amresco | J850 (yeast extract) 0122 (mannitol) | |
Water deficit treatment | |||
KNO3 | Merck | 221295 | |
Porometer | Decagon Device | Model SC-1 | |
Scalpel | |||
Preparation of cytosolic extracts | |||
Brij L23 | Sigma-Aldrich | P1254 | |
Centrifuge | Sigma | Model 2K15 | |
Chloranphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C7698 | |
DOC | Sigma-Aldrich | 30970 | |
DTT | Sigma-Aldrich | D9779 | |
EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
Igepal CA 360 | Sigma-Aldrich | I8896 | |
KCl | Merck | 1.04936 | |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
Plastic tissue grinder | Fisher Scientific | 12649595 | |
PMSF | Sigma-Aldrich | P7626 | |
PTE | Sigma-Aldrich | P2393 | |
Tris | Invitrogen | 15504-020 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
Weighing dish | Deltalab | 1911103 | |
Preparation of sucrose cushions | |||
Sucrose | Invitrogen | 15503022 | |
SW 40 Ti rotor | Beckman-Coulter | ||
Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | Optima L-100K | |
Ultracentrifuge tubes | Beckman-Coulter | 344059 | 13.2 mL tubes |
RNA extraction and quality control | |||
Agarose | Thermo scientific | R0492 | |
Bioanalyzer | Agilent | Model 2100. Eukaryote total RNA nano assay | |
Chloroform | DI | 41191 | |
Ethanol | Dorwil | UN1170 | |
Isopropanol | Mallinckrodt | 3032-06 | |
Glycogen | Sigma | 10814-010 | |
TRIzol LS | Ambion | 102960028 | |
Miscellaneous | |||
Falcon tubes 15 mL | Biologix | 10-0152 | |
Filter tips 10 µL | BioPointe Scientific | 321-4050 | |
Filter tips 1000 µL | BioPointe Scientific | 361-1050 | |
Filter tips 20 µL | BioPointe Scientific | 341-4050 | |
Filter tips 200 µL | Tarsons | 528104 | |
Microcentrifuge tubes 1.5 mL | Tarsons | 500010-N | |
Microcentrifuge tubes 2.0 mL | Tarsons | 500020-N | |
Sequencing company | Macrogen | ||
Sterile 250 mL flask | Marienfeld | 4110207 |