Summary
Hier wordt een protocol gepresenteerd voor het genereren van formaline-vaste, paraffine-ingebedde celpelletcontroles voor immunohistochemie.
Abstract
Positieve en negatieve controles met bekende expressie van doeleiwitten zijn essentieel voor de ontwikkeling van immunohistochemische (IHC) assays. Hoewel weefselcontroles gunstig zijn voor goed gekarakteriseerde eiwitten met gedefinieerde weefsel- en cellulaire expressiepatronen, zijn ze minder geschikt voor de initiële ontwikkeling van IHC-testen voor nieuwe, slecht gekarakteriseerde of alomtegenwoordig tot expressie gebrachte eiwitten. Als alternatief, vanwege hun gestandaardiseerde aard, kunnen celpellets, inclusief kankercellijnen met gedefinieerde eiwit- of transcriptexpressieniveaus (bijv. Hoge, gemiddelde en lage expressie), getransfecteerde overexpressie van cellijnen of cellijnen met genen verwijderd door celtechnologietechnologieën zoals CRISPR, dienen als waardevolle controles, vooral voor de initiële karakterisering en selectie van antilichamen. Om deze celpellets te kunnen gebruiken bij de ontwikkeling van IHC-testen voor formaline-gefixeerde, paraffine-ingebedde weefsels, moeten ze worden verwerkt en ingebed op een manier die de procedures die worden gebruikt voor weefselverwerking samenvat. Dit protocol beschrijft een proces voor het creëren en verwerken van formaline-vaste, paraffine-ingebedde celpelletcontroles die kunnen worden gebruikt voor IHC-methodeontwikkelingen.
Introduction
Immunohistochemie (IHC) is een van de meest gebruikte testen in onderzoeks- en diagnostische pathologie. Afhankelijk van de context en de test wordt IHC gebruikt om te helpen bij kankerdiagnose 1,2, behandelingsrespons 3,4 te voorspellen, pathogenen5 te identificeren, celtypen in zieke weefsels te karakteriseren6 en biologische routes en weefselresponsen te bestuderen 7,8. In alle situaties is het basisprincipe van een IHC-test dat een antilichaam specifiek bindt aan een doelwit van belang, meestal een eiwit, en deze bindingsgebeurtenis wordt vervolgens gevisualiseerd in een weefselsectie9. Een van de grootste uitdagingen van elke IHC-test is echter ervoor te zorgen dat de antilichamen specifiek het doel van belang detecteren10. Antilichaamspecificiteit is een uitdaging in de meeste immunoassays, maar immunohistochemie biedt unieke uitdagingen omdat er geen secundaire maatregelen zijn, zoals molecuulgewicht, om onderscheid te maken tussen specifieke en niet-specifieke etikettering. Dit is vooral lastig bij het evalueren van slecht gekarakteriseerde of alomtegenwoordig uitgedrukte doelen die geen goed gedefinieerde cellulaire lokalisatiepatronen hebben. Daarom zijn robuuste controles die kunnen helpen bij het karakteriseren van bindingsspecificiteit van cruciaal belang bij het ontwikkelen van een nieuwe IHC-test10.
Voor doelen die goed gedefinieerd zijn met karakteristieke cellulaire expressiepatronen, worden weefselcontroles vaak gebruikt in IHC-methodeontwikkelingen. Op basis van een schat aan eerdere gegevens kan men bepalen of het antilichaam het weefsel, de cel en het subcellulaire compartiment labelt waarin het tot expressie komt, en dat het geen weefselcomponenten labelt waar het niet aanwezig zou moeten zijn11. Weefselcontroles zijn echter van beperkt nut voor slecht gekarakteriseerde, nieuwe doelen zonder bekende expressiepatronen of voor eiwitten die op grote schaal tot expressie komen en geen duidelijke expressiepatronen hebben. In beide scenario's maakt het ontbreken van een goed gedefinieerd expressiepatroon het onmogelijk om specifieke van niet-specifieke etikettering in weefsels te onderscheiden. In deze situaties bieden celpellets een waardevol alternatief IHC-controle. Celpelletcontroles kunnen zijn: kanker of andere cellijnen die endogene of intrinsieke / niet-geïnduceerde expressieniveaus van het eiwit van belang hebben, en waarvan de eiwitexpressie kan worden gekenmerkt door western blotting, flowcytometrische analyses of geëxtrapoleerd uit transcriptionele profilering; gemanipuleerde cellijnen die ofwel het eiwit van belang overexpressie geven of het coderende gen van belang laten verwijderen; of cellen die onder specifieke omstandigheden zijn behandeld om eiwitexpressie of signaalgebeurtenissen van belang te induceren (bv. fosforylering)10,12. Goed gekarakteriseerde eiwitexpressieniveaus in cellijnen maken ook evaluatie van de gevoeligheid van een test mogelijk door een paneel van cellijnen met hoge, gemiddelde, lage en afwezige eiwitexpressie te gebruiken. Bovendien kunnen gemanipuleerde celpellets waardevolle soortspecifieke controles zijn voor veterinaire soorten, waarvoor er beperkte karakterisering of beschikbare weefselcontroles kunnen zijn13. Hoewel celpellets hun beperkingen hebben, zoals het beperkte proteoom dat aanwezig is in cellijnen die het diverse proteoom in weefsels niet weerspiegelen, dienen ze als geschikte controles om te bevestigen dat het antilichaam het doelwit van belang kan detecteren en om willekeurige binding door het primaire antilichaam, secundair antilichaam of andere regenten in de test uit te sluiten10.
De meeste weefsels in diagnostische en onderzoekende pathologie zijn gefixeerd in neutraal gebufferd formaline, gedehydrateerd in een reeks alcoholen, geklaard in xyleen en verwerkt en ingebed in paraffinewas. Formalinefixatie kruist eiwitten en fixatie en elke extra stap in weefselverwerking kan rechtstreeks van invloed zijn op eiwitten en het vermogen van antilichamen om ze te detecteren 9,14. Daarom is het belangrijk dat alle controles die in een IHC-test worden gebruikt, dezelfde fixatie-, weefselverwerkings- en inbeddingsprocedures ondergaan. Dit artikel beschrijft de unieke overwegingen om gekweekte cellen te verwerken en in te bedden om te dienen als controles voor het ontwikkelen van IHC-assays in formaline-gefixeerde paraffine ingebedde weefsels, waarbij de methodologie zich voornamelijk richt op de behandeling en verwerking van de celpellet in een histologisch laboratorium.
Protocol
1. Bereiding van celpellets
- In vier tot acht kolven van 150 mm2 of acht x T175 groeien cellen in het medium en de omstandigheden die worden aanbevolen voor de cellijn tot 80% -90% samenvloeiing. Kweek bijvoorbeeld 293T-cellen in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) met 10% foetaal runderserum en 2 mM L-glutamine15.
OPMERKING: Cellen moeten worden gekweekt met behulp van de omstandigheden en het medium die nodig zijn voor de cellijn van belang16. Deze omstandigheden kunnen variëren afhankelijk van de cellijn, maar de downstream pelletingmethoden moeten aanpasbaar zijn voor cellijnen onafhankelijk van kweekomstandigheden. - Zodra cellen in de buurt van samenvloeiing zijn (80% -90%), ademt u de groeimedia op met een vacuümpipet en spoelt u de cellen in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS).
- Voeg 5 ml 5-10 mM EDTA toe aan elke kolf en incubeer de kolven bij 37 °C gedurende 5-10 minuten. Tik voorzichtig op de zijkant van de kolf om de cellen los te maken.
OPMERKING: Gebruik geen trypsine omdat dit oppervlakte-epitopen kan splijten die sommige antigenen nadelig zouden beïnvloeden.- Zodra de cellen zijn losgemaakt, voegt u 5 ml groeimedia toe die voor de cellijn worden gebruikt (bijv. DMEM voor 293T-cellen) aan elke kolf en breng de cellen vervolgens over in conische buizen van 50 ml.
- Centrifugeer de conische buizen bij 930 x g bij kamertemperatuur gedurende 5 min. Verwijder na centrifugatie het medium en EDTA door vacuümpipetaspiratie.
- Was de celpellets in 10-20 ml 1x PBS en, indien meerdere platen of kolven worden gebruikt, bundel de cellen van de platen of kolven (ongeveer zes T175-kolven in het in figuur 1 afgebeelde experiment) in één conische buis van 50 ml.
- Centrifugeer de buis bij 930 x g gedurende 5 min. Aspirateer de PBS na centrifugeren met een vacuümpipet.
- Houd de buis van de celpellet op nat ijs totdat deze is gefixeerd.
OPMERKING: Cellen worden gekoeld gehouden om de afbraak van enzymactiviteit te beperken en de autolyse van cellen en bijbehorende eiwitveranderingen te minimaliseren, inclusief veranderingen in eiwitlokalisatie.
2. Fixatie van celpellets
- Voer fixatie uit door 30 ml 10% neutraal gebufferd formaline toe te voegen aan 3 ml celpellet om een fixatieve verhouding van 10: 1 (vol: vol) te creëren.
- Keer de goed afgedekte buis van 50 ml herhaaldelijk om totdat de cellen volledig in suspensie zijn.
OPMERKING: Vorming van een gecondenseerde celpellet vóór volledige fixatie kan ongelijke fixatie veroorzaken, wat resulteert in artefacten tijdens latere kleurings- en immunolabelingsprocedures. - Laat de celsuspensie 's nachts bij kamertemperatuur bezinken.
- Keer de buis de volgende dag opnieuw om de cellen te resuspenderen, waardoor de verhouding tussen oppervlak en volume toeneemt om de fixatie te verbeteren.
OPMERKING: Vortexing van de celpellet is niet vereist of aanbevolen omdat dit kan leiden tot celbeschadiging.
3. Trimmen en verwerken van celpellets
- Na 24 uur fixatie, centrifugeer de 50 ml conische buis bij 930 x g bij 5 °C gedurende 10-15 minuten. Zorg ervoor dat de buizen goed zijn afgedekt, gelijkmatig verdeeld en in balans zijn in de centrifuge.
OPMERKING: Fixatietijden kunnen worden aangepast om de weefselfixatietijden weer te geven die door het laboratorium worden gebruikt of vereisten van specifieke experimentele omstandigheden. - Zorg er na centrifugeren voor dat de cellen een zichtbare pellet vormen. Verwijder fixatief door te decanteren en/of voorzichtig te aspirateren met steriele transferpipet.
- Voeg gesmolten (40-60 °C) gel op basis van hydroxyethyl agarose (zie Materiaaltabel) toe aan de celpellet in een verhouding van 1:4 (vol:vol) gel/celpellet.
- Roer met behulp van een schone Sterling-sonde met een 5-inch, 2 mm punt met een oog gespoeld met kraanwater, de gesmolten gel voorzichtig in de pellet met vaste cel, waardoor een gelijkmatige suspensie van vaste cellen in gesmolten gel ontstaat aan de onderkant van de conische buis van 50 ml (figuur 1A).
- Plaats de afgedekte conische buis van 50 ml met de gesmolten gel gemengd met vaste celpellet gedurende 5-10 minuten op nat ijs om de gelled celpellet te stollen.
- Gebruik een schone microspatel om de pellet voorzichtig uit de conische buis te verwijderen door een spatel langs de zijkant van de buis te plaatsen en de pellet voorzichtig te gebruiken zonder deze te doorboren. Leg de pellet op biopsiepapier.
- Snijd met behulp van een schone microspatel de celpellet in 4-5 mm dikke plakken, zodat elke plak in een weefselcassette van 26 mm x 26 mm x 5 mm past (figuur 1B).
- Plaats individuele plakjes gelpellet in het midden van een stuk biopsiepapier. Vouw de twee tegengestelde uiteinden van het biopsiepapier over de pellet en wikkel het in. Plaats de ingepakte pellet in een tissuecassette van 26 mm x 26 mm x 5 mm. Sluit het deksel en krimp de uitgevouwen zijkanten van de biopsiewikkel met het deksel van de tissuecassette (figuur 1C).
- Plaats de bijgesneden celpelletcassette in de retort van de weefselprocessor gevuld met 10% neutraal gebufferd formaline en voer een kort verwerkingsschema uit.
OPMERKING: Het korte verwerkingsschema bestaat uit 30 minuten in elke retort, beginnend in 10% neutraal gebufferd formaline, gedehydrateerd door een reeks steeds meer gesorteerde alcoholen, geklaard in drie veranderingen van xylenen, en eindigend met paraffine-infiltratie in twee veranderingen van 60 °C gesmolten infiltratie/inbedding paraffine (smeltpunt van 56 °C).
4. Inbedding van celpellets
- Plaats de verwerkte cassettes in het bewaargebied van het insluitcentrum.
- Open het deksel van de tissuecassette en vouw het biopsiepapier voorzichtig open.
- Plaats de celpellet in een kleine wegwerpmal van 15 mm x 15 mm, met de gesneden kant naar beneden.
OPMERKING: Een kleine inbeddingsvorm maakt het mogelijk om maximaal drie celpelletsecties op één niet-gekleurd weefselglaasje te plaatsen voor IHC-testen. - Terwijl u de celpellet voorzichtig met een tang in de bodem van de mal houdt, voegt u 62 °C weefselinfiltratie / inbedding van paraffine in de mal toe en bedekt u de celpellet.
- Verplaats de schimmel naar een koud blok om de paraffine te laten stollen. Pas de celpellets aan terwijl de paraffine stolt om ze in hun juiste positie aan de onderkant van de mal te bevestigen.
- Verwijder het deksel van de cassette. Plaats de cassette met de onderkant naar beneden op de insluitvorm en voeg extra gesmolten paraffine toe om de cassette te bedekken.
- Wanneer paraffine over de weefselcassette is gevuld, brengt u de mal terug naar het koude blok om17,18 te stollen.
5. Sectie van celpellets
- Gebruik een roterende microtoomset met een doorsnededikte van 20 μm om het celpelletblok bij te snijden totdat het volledige oppervlak van het paraffineblok en de celpellet is opgevangen in het lint van de paraffinesectie. Dit wordt "tegenover" het blok" genoemd.
- Koel en week de pelletblokken op een ijsbadbak gedurende 5-15 minuten om het blok te koelen en te hydrateren voordat het wordt doorgesneden.
OPMERKING: Wanneer het blok is gehydrateerd, zal de celpellet doorschijnend zijn in het paraffinelint. Als het ondoorzichtig is, is meer weken vereist en kunnen artefacten aanwezig zijn. - Doorsnijd het paraffinelint van het celpelletblok met een dikte van 4 μm of een andere gewenste dikte in continue snijmodus met behulp van een roterend microtoom.
- Plaats de paraffinelinten op een water floatatiebad ingesteld op 42 °C.
- Pak de paraffinesecties die met behulp van de roterende microtoom zijn bereid uit het floatatiebad op positief geladen dia's.
- Plaats het eerste gedeelte bovenaan de dia binnen de afdekplaat en de kleuringsgrens, plaats het tweede eronder en het derde celpelletgedeelte daaronder (figuur 1D).
- Droog na het snijden de dia's bij kamertemperatuur (ongeveer 23 °C) gedurende 24 uur, gevolgd door 60 °C gedurende 30 minuten.
OPMERKING: Na het bakken van de dia's op 60 °C kunnen de celpelletsecties worden gebruikt met elk standaard IHC-protocol, inclusief protocollen met behulp van warmte-geïnduceerde en op enzymen gebaseerde antigeenterugwinningen9.
Representative Results
Na toevoeging van de gel op basis van agarose moet de celpellet een vaste gelatineuze massa vormen die geschikt is voor hantering (figuur 1B). Eenmaal ingebed, zal de pellet een consistentie hebben die vergelijkbaar is met een vast weefsel en moet het relatief gemakkelijk zijn om routinematig op een microtoom te snijden. Zodra celpellets zijn ingebed, kunnen ze op identieke wijze worden gebruikt in histologie- en IHC-experimenten als formaline-gefixeerde, paraffine-ingebedde weefsels. Dit omvat het gebruik van warmte-geïnduceerde epitoop of enzymatische antigeenopvraging met indirecte chromogene detectiemethoden (bijvoorbeeld met behulp van een secundair antilichaam met mierikswortelperoxidase en diaminobenzidinedetectie zoals weergegeven in figuur 2 en figuur 3) met behulp van commerciële IHC-platforms9. Histologisch moeten de cellen gelijkmatig door de sectie worden verspreid met minimale celklontering, hoewel adherente cellen hun cel-celinteracties in de pellet kunnen behouden. Deze dispersie maakt onderscheid tussen individuele cellen mogelijk, hoewel dit onderscheid aanzienlijk zal worden beïnvloed door de celgrootte en relatieve dichtheid binnen de gelpellet. De kern, het cytoplasma en het celmembraan zijn duidelijker en gemakkelijker te visualiseren bij dispersie (figuur 2). In figuur 2 zijn drie cellijnen immuungelabeld voor de TEAD-transcriptiefactor. Immunolabeling wordt gevisualiseerd met het bruine diaminobenzidine (DAB) chromogeen. De cellijnen hebben verschillende expressieniveaus van de TEAD-transcriptiefactor, variërend van geen expressie (figuur 2A) tot zwakke expressie (figuur 2B) tot sterke expressie (figuur 2C). In dit voorbeeld wordt etikettering waargenomen in de kern, zoals zou worden verwacht van een transcriptiefactor, en is afwezig in het cytoplasma en het celmembraan, die zichtbaar zijn maar geen etikettering hebben (figuur 2). Celpellets kunnen worden opgenomen in microarrays van celpellets (figuur 3) op standaard dia's van 23 mm x 75 mm x 1 mm. Het opnemen van de celpellets in een microarray maakt de evaluatie mogelijk van controles met verschillende expressieniveaus in dezelfde dia. In dit voorbeeld dienen PEG10-deficiënte embryonale stamcellen van muizen (links) als een negatieve controle en 293T-cellen die PEG10 overexpressie geven (rechts, bruine immunolabeling) dienen als een positieve controle in de microarray (figuur 3). Er is geen variatie in het weefsel en de inbeddingsprocedures voor celpellets die zullen worden opgenomen in microarrays, en microarrays kunnen worden gegenereerd met behulp van methoden die vergelijkbaar zijn met die welke worden gebruikt voor weefsels19.
Figuur 1: Verwerking van celpellets. (A) Cellen worden gepelletiseerd in conische buisjes van 50 ml en gemengd met de gel. (B) Eenmaal gestold, worden pellets serieel gesneden om in een tissuecassette van 26 mm x 26 mm x 5 mm te passen. (C) Celpellets worden in biopsiepapier gewikkeld voordat ze in de tissueprocessor worden geplaatst. (D) Maximaal driecellige pellets kunnen serieel worden verzameld op een enkele 25 mm x 75 mm glazen histologieplaat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Celpellets met verschillende niveaus van eiwit- of transcriptexpressie kunnen worden gebruikt om het dynamische bereik van de test te evalueren. Celpellets zijn immunoactief gelabeld voor de TEAD-transcriptiefactor en vertonen verschillende niveaus van TEAD-expressie. (A) DAUDI-cellen missen TEAD-expressie en hebben geen immunolabeling in het cytoplasma of de kern. Blauwe vlek is hematoxyline counterstain van de kern. (B) 293T-cellen vertonen een zwakke nucleaire etikettering (bruin diaminobenzidine (DAB) chromogeen) van de TEAD-transcriptiefactor. (C) Detroit 562-cellen drukken TEAD sterk uit, zoals blijkt uit de intense bruine etikettering in de kern. Etikettering in de kern, maar niet het cytoplasma (gebroken wit tot grijs gebied rond de bruine kern), toont de juiste etikettering van de immunohistochemische test. Merk op dat in alle drie de cellijnen de cellen worden verspreid, waardoor de visualisatie van individuele cellen mogelijk is, inclusief hun nucleaire en cytoplasmatische morfologieën. Schaalbalk = 25 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Cell pellet microarray gecreëerd door het gebruik van meerdere cel pellets met verschillende eiwitexpressieniveaus maakt de gelijktijdige beoordeling van controles in een enkele dia mogelijk. PEG10-deficiënte embryonale stamcellen van muizen (links) en 293T-cellen die PEG10 te veel tot expressie brengen (rechts) zijn immunoactief gelabeld voor PEG10. Hoewel sterke etikettering (bruin DAB-chromogeen) wordt waargenomen in 293T-cellen die PEG10 overexpressie geven, is er geen labeling zichtbaar in PEG10-deficiënte cellen. Blauw staat voor hematoxyline counterstain. Schaalbalk = 200 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Discussion
Dit protocol beschrijft een methodologie om formaline-vaste, paraffine-ingebedde celpellets te genereren die kunnen worden gebruikt als controles voor downstream immunohistochemie en in situ hybridisatiestudies. De histologische methodologieën die in dit protocol worden beschreven, zijn van toepassing op een breed scala aan kanker- en primaire cellijnen en passen voornamelijk routinematige histologische technieken aan om deze pellets te produceren17,18. Wanneer ze worden verwerkt en ingebed, kunnen de pellets op dezelfde manier worden gebruikt als weefsels. Dit omvat het gebruik ervan met warmte-geïnduceerde en enzymatische antigeen ophaalprotocollen voor immunohistochemische experimenten. Een doel van de methodologieën die in dit protocol worden gebruikt, is om de morfologie en antigeniciteit van de cellen gedurende het hele proces te behouden. Daarom wordt EDTA, dat relatief zacht is in termen van veranderingen in zowel de morfologie als de antigeniciteit, gebruikt voor het losmaken van de cellen. Dit wil niet zeggen dat andere benaderingen, zoals fysieke verstoring, niet levensvatbaar zijn; elke benadering om cellen los te maken moet er echter voor zorgen dat de cellen niet gewond raken tijdens het proces. Het tweede doel van dit protocol is om de cellen te fixeren en te verwerken op een manier die vergelijkbaar is met weefsels, met behulp van dezelfde fixatieve, fixatieve ratio, verwerkingsschema (fixatie, dehydratie, clearing en paraffine-infiltratie) en inbeddingstechnieken, zodat ze kunnen dienen als vergelijkbare controles voor downstream-testen. Daarom moeten de fixatie- en verwerkingsbenaderingen die worden gebruikt om celpellets te genereren, de benaderingen nabootsen die voor weefsels worden gebruikt.
Het protocol dat in dit rapport wordt beschreven, is niet aangepast om cellen met infectieuze agentia te behandelen, zoals cellen die zijn geïnfecteerd met pathogene bacteriën of virussen, omdat cellen worden losgemaakt, verzameld en gecentrifugeerd voordat ze worden gefixeerd. Onderzoekers kunnen protocollen overwegen om de cellen te fixeren voordat ze worden losgemaakt, maar dit zou verdere optimalisatie vereisen om de cellen te verzamelen zonder de celmorfologie te verstoren. Bovendien vereisen fixatietijden en behandelingsomstandigheden voor cellen met infectieuze agentia aanvullende overwegingen op basis van het infectieuze agens en de bijbehorende institutionele bioveiligheidsprotocollen.
Formaline-vaste, paraffine-ingebedde celpellets zijn uniek voordelig in het hebben van goed gedefinieerde eiwitexpressieniveaus10. Terwijl kanker en endogene cellijnen een selectie van cellen met verschillende niveaus van eiwitexpressie bieden, stellen genetische manipulatietechnologieën wetenschappers in staat om de eiwitexpressie te modelleren, door middel van overexpressie van interessante eiwitten en het gebruik van CRISPR-technologieën om coderende genen van belang te verwijderen of in te voegen20,21 . Het nadeel van overgeexpresseerde eiwitten in cellijnen is dat het slechte maatstaven zijn voor de gevoeligheid van een test, omdat ze mogelijk geen endogene eiwitniveaus22 vertegenwoordigen. Daarentegen kunnen zowel endogene cellijnen als kankercellijnen de endogene expressieniveaus beter weergeven, en CRISPR-gemedieerde deletie van het coderende gen in een cognatelijn kan dienen als een overeenkomstige negatieve controle. Bovendien zijn endogene cellijnen of kankercellijnen met verschillende niveaus van eiwitexpressie ideaal voor titratie-experimenten om uiteindelijke antilichaamverdunningen te kiezen en de gevoeligheid van een test het beste te begrijpen (figuur 2). De beslissing over welke cellijnen te gebruiken moet gebaseerd zijn op individuele experimentele behoeften en zal vaak een combinatie van benaderingen gebruiken.
Naast het evalueren of een antilichaam het eiwit van belang kan detecteren, kan een panel van cellijnen worden gebruikt om de specificiteit van een antilichaam te definiëren. Een panel van cellijnen die individueel een familie van nauw verwante eiwitten tot expressie brengen, kan bijvoorbeeld worden gebruikt om te testen of een antilichaam specifiek is voor een individueel eiwit of dat het ook andere nauw verwante eiwitten detecteert. Meer uitgebreide controles kunnen betrekking hebben op het gebruik van cellijnen die, hetzij door CRISPR knock-in of door overexpressie, eiwitten tot expressie brengen met puntmutaties die geen specifieke signaleringsgebeurtenissen kunnen ondergaan die worden gedetecteerd (bijvoorbeeld mutatie in specifieke fosforyleringsplaatsen bij het evalueren van een fosfo-specifiek antilichaam). Hoewel dit complexere benaderingen zijn, kunnen ze nodig zijn om te bevestigen dat het antilichaam onder specifieke omstandigheden alleen labels gebruikt10.
Het is belangrijk op te merken dat genetische manipulaties van cellijnen mogelijk geen homogene celpopulatie genereren. De transfectie-efficiëntie bij het overexpressie van cellijnen is bijvoorbeeld meestal niet 100% en sommige cellen kunnen het eiwit van belang niet overexpressie geven. Opname van FLAG of een gerelateerde tag in de transfectie die met standaardmethoden kan worden gedetecteerd, kan nuttig zijn om de transfectie-efficiëntie van de cellijn te beoordelen23. Dit kan nuttig zijn om te bepalen of transfectie succesvol was en om een gebrek aan detectie als gevolg van de eiwitexpressie uit te sluiten, en om als referentie te dienen voor het verwachte aandeel cellen dat het eiwit van belang zou moeten uitdrukken.
In situ hybridisatie (ISH) kan ook een nuttig hulpmiddel zijn om de doelgenexpressie in celpellets te karakteriseren en de ontwikkeling van IHC-methodente informeren 10. Bij het screenen van antilichamen kan het informatief zijn om te weten wanneer het transcript, en dus het potentiële eiwit, kan worden gedetecteerd. Bovendien kan ish-screening van celpellets gunstig zijn voor de ontwikkeling van ish-methoden. Hoewel specificiteit minder vaak een probleem is voor ISH-assays, is het nog steeds belangrijk om geschikte controles en soortgelijke overwegingen te hebben voor de ontwikkeling en het gebruik van controles die kunnen worden toegepast op ISH-studies.
Weefselmicroarrays worden gecreëerd door kernen uit donorblokken te verwijderen en deze kernen, vaak in een rasterpatroon, over te brengen in een ontvangend paraffineblok. Uiteindelijk bevat het ontvangersblok een spectrum van monsters in een enkel blok, waardoor alle monsters in het blok identieke IHC-procedures kunnen doorlopen en de directe vergelijking van meerdere monsters op dezelfde diamogelijk is 24,25. Omdat celpellets relatief uniforme populaties zijn, kunnen ze nauwkeurig worden weergegeven door 1 mm-kernen, waardoor ze ideale kandidaten zijn voor opname in vergelijkbare arrays. Met behulp van een celpelletarray is het mogelijk om celpellets met verschillende expressieniveaus, celpellets die op unieke wijze verwante eiwitten tot expressie brengen, en celpellets die orthologen van het eiwit van belang van verschillende soorten in één dia tot expressie brengen (figuur 3). Hierdoor kunnen alle celpellets tegelijkertijd onder uniforme omstandigheden op een snelle manier worden geëvalueerd, terwijl het gebruik van reagentia wordt geminimaliseerd25.
Een minimaal volume startcelpellets van 2 ml verzameld uit acht T175-kolven wordt aanbevolen voor dit protocol. Dit volume maakt de productie en archivering van meerdere celpelletblokken mogelijk, zodat celpelletcontroles over langere perioden kunnen worden gestandaardiseerd en meerdere celpelletarrays kunnen worden gemaakt van een bepaalde pellet. Lagere celpelletvolumes kunnen worden gebruikt bij het omgaan met primaire patiënt-afgeleide cellijnen, langzaam groeiende cellijnen of wanneer omstandigheden het volume van het monster beperken. Natuurlijk zullen lagere startvolumes de negatieve impact van elk celverlies tijdens fixatie en bereiding van de pellet versterken en het materiaal dat beschikbaar is voor downstream-processen beperken. Het is vooral belangrijk om voorzichtig te zijn bij het verwijderen van fixatief na centrifugatie, om eventuele bijbehorende verliezen te minimaliseren. Voor lagere monstervolumes kan een centrifugebuis van 1,5 ml worden gebruikt om de cellen te pelleteren. Deze buizen kunnen in de lengterichting worden doorsneden met een mes voor verwerking.
Net als bij weefselfixatie is celfixatie in deze pellet van cruciaal belang voor downstream IHC-beoordelingen. Om volledige fixatie te bereiken, gebruiken we ten minste een 10: 1 formaline-celpelletverhouding en keren we de conische buis om de cellen in suspensie te houden. Als de cellen niet in suspensie zijn op het moment van fixatie, bestaat het risico van onvolledige of ontoereikende fixatie, wat de downstream immunolabeling zal beïnvloeden. Vaak manifesteert dit zich als sterke etikettering in de periferie en verlies van etikettering in het midden van de pellet of etikettering van variabele intensiteit in de pellet.
Dit protocol maakt gebruik van Histogel, dat voornamelijk bestaat uit hydroxyethyl agarose, om zowel de celpellet te binden als om de cellen gelijkmatig over de celpellet te verdelen. Zonder dit worden cellen verdicht en verliezen ze hun cytomorfologische details. Deze cytomorfologische details zijn vaak belangrijk tijdens antilichaamscreening, omdat ze aanvullende informatie geven over de vraag of het antilichaam zich in het juiste subcellulaire compartiment (bijv. De kern, het cytoplasma of het plasmamembraan) labelt. Daarentegen kan te veel gel resulteren in lagere celdichtheden in de pellet, waardoor de cellen wijd verspreid zijn en het aantal cellen per sectie wordt verminderd.
Dit protocol kan routinematig worden gebruikt om IHC-controles te ontwikkelen. De materialen die nodig zijn om deze pellets te maken, zijn gebruikelijk in laboratoria voor onderzoeksbiologie en histologie, en de methoden zijn eenvoudig en gemakkelijk aan te passen. Hoewel celpellets beperkingen hebben als IHC-controles, dienen ze als geweldige hulpmiddelen voor initiële antilichaamscreening en vullen ze andere weefselcontroles aan.
Disclosures
Alle auteurs zijn werknemers van Genentech/ Roche en zijn als zodanig aandeelhouder van Roche.
Acknowledgments
We willen graag de samenwerking erkennen van onze collega's in de genentech's onderzoeksorganisatie, en in het bijzonder de pathologiekern (P-core) laboratoria die hebben bijgedragen aan de ontwikkeling van deze methoden door de jaren heen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR | 16004-128 | |
| 50 mL Conical Tube | Becton Dickinson Labware | #0747-1886 | |
| 70% Ethanol | Koptec | V1401 | |
| 95% Ethanol | Koptec | V1101 | |
| Biopsy Wraps | Surgipath Medical Industries, Inc | #01090 | |
| Costar Stripette serological pipette 10mL | Corning | CLS4101 | |
| Flex 100 | Epredia | 8101 | |
| Flex 95 | Epredia | 8201 | |
| Histogel | Thermo Scientific | #R904012 | |
| Leica Automated Rotary Microtome | Leica | RM2255 | |
| Micro Spatula, rounded and tapered ends | Tedd Pella | #13510 | |
| NanoZoomer 2.0 HT whole slide imager | Hamamatsu | ||
| Paraplast Tissue Infiltration/Embedding Paraffin | Surgipath | 39601006 | |
| Pipette Controller | CAPP | PA-100 | |
| Reagent Alcohol | Epredia | 9111 | |
| Sterling Probe 5” 2mm Tip with Eye | Roboz Surgical Instrument Co., Inc | #RS-9522 | |
| Superfrost Plus positively charged microscope slides | Thermo Scientific | 6776214 | |
| Tissue cassettes; PrintMate Slotted Cassette | Epredia | B851120WH | |
| TMA Tissue Grand Master | 3DHistech LTD | ||
| Xylenes | VWR | 89370-088 |
References
- Wennerberg, A. E., Nalesnik, M. A., Coleman, W. B. Hepatocyte paraffin 1: a monoclonal antibody that reacts with hepatocytes and can be used for differential diagnosis of hepatic tumors. American Journal of Pathology. 143 (4), 1050-1054 (1993).
- Chu, P. G., Ishizawa, S., Wu, E., Weiss, L. M. Hepatocyte antigen as a marker of hepatocellular carcinoma. American Journal of Surgical Pathology. 26 (8), 978-988 (2002).
- Cobleigh, M. A., et al. Multinational study of the efficacy and safety of humanized anti-HER2 monoclonal antibody in women who have HER2-overexpressing metastatic breast cancer that has progressed after chemotherapy for metastatic disease. Journal of Clinical Oncology. 17 (9), 2639-2648 (1999).
- Vogel, C. L., et al. Efficacy and safety of trastuzumab as a single agent in first-line treatment of HER2-overexpressing metastatic breast cancer. Journal of Clinical Oncology. 20 (3), 719-726 (2002).
- Webster, J. D., Miller, M. A., DuSold, D., Ramos-Vara, J. A. Effects of prolonged formalin fixation on the immunohistochemical detection of infectious agents in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Veterinary Pathology. 47 (3), 529-535 (2010).
- Havnar, C., et al. Characterization of tumor-immune microenvironment by high-throughput image analysis of CD8 immunohistochemistry combined with modified Masson's trichrome. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 69 (9), 611-615 (2021).
- Newton, K., et al. RIPK1 inhibits ZPB1-driven necroptosis during development. Nature. 540 (7631), 129-133 (2016).
- Webster, J. D., Solon, M., Haller, S., Newton, K. Detection of necroptosis by phospho-RIPK3 immunohistochemical labeling. Methods in Molecular Biology. 1857, 153-160 (2018).
- Ramos, J. A., Miller, M. A., et al. When antibodies and antigens get along: revisiting the technical aspects of immunohistochemistry-the red, brown, and blue technique. Veterinary Pathology. 51 (1), 42-87 (2014).
- Webster, J. D., Solon, M., Gibson-Corley, K. N. Validating immunohistochemistry assay specificity in investigative studies: consideration for a weight of evidence approach. Veterinary Pathology. 58 (5), 829-840 (2021).
- Ramos-Vara, J. A., et al. American association of veterinary laboratory diagnosticians subcommittee on standardization of immunohistochemistry suggested guidelines for immunohistochemical techniques in veterinary diagnostic laboratories. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 20 (4), 393-413 (2008).
- Dominguez, S., et al. Genetic inactivation of RIP1 kinase does not ameliorate disease in a mouse model of ALS. Cell Death and Differentiation. 28 (3), 915-931 (2021).
- Lean, F. Z. X., et al. Differential susceptibility of SARS-CoV-2 in animals: evidence of ACE2 host receptor distribution in companion animals, livestock and wildlife by immunohistochemical characterization. Transboundary and Emerging Disease. , 14232 (2021).
- Dunstan, R. W., Wharton, K. A., Quigley, C., Lowe, A. The use of immunohistochemistry for biomarker assessment-can it compete with other technologies. Toxicologic Pathology. 39 (6), 988-1002 (2011).
- Atcc.org. , Available from: http://www.atcc.org (2022).
- Thermo Fisher Scientific. Cell Culture Basics Handbook. , Gibco. (2020).
- Carson, F. Histotechnology: A Self-Instructional Text, 2nd Ed. , ASCP Press. Chicago, IL. (1997).
- Suvarna, S. K., Layton, C., Bancroft, J. D. Tissue Processing. Bancroft's Theory and Practice of Histological Techniques, 7th Ed. Spencer, L. T., Bancroft, J. D. , Churchill Livingstone-Elsevier. China. (2013).
- Dancau, A. M., Simon, R., Mirlacher, M., Sauter, G. Tissue Microarrays. Cancer Gene Profiling. , Humana Press. New York. 53-65 (2016).
- Jinek, M., et al. Programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Jinek, M., et al. RNA-programmed genome editing in human cells. eLife. 2, 00471 (2013).
- Hewitt, S. M., Baskin, D. G., Frevert, C. W., Stahl, W. L., Rosa-Molinar, E. Controls for immunohistochemistry: The Histochemical Society's standards of practice for validation of immunohistochemical assays. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 62 (10), 693-697 (2014).
- Ferrando, R., Newton, K., Chu, F., Webster, J., French, D. Immunohistochemical detection of FLAG-tagged endogenous proteins in knock-in mice. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 63 (4), 244-255 (2015).
- Kononen, J., et al. Tissue microarrays for high-throughput molecular profiling of tumor specimens. Nature Medicine. 4 (7), 844-847 (1998).
- Moch, H., Kononen, J., Kallioniemi, O. P., Sauter, G. Tissue microarrays: what will they bring to molecular and anatomic pathology. Advances in Anatomic Pathology. 8 (1), 14-20 (2001).
