एक उच्च-थ्रूपुट माइक्रोफ्लुइडिक संपीड़न प्रणाली के माध्यम से बहुकोशिकीय जीवों का मेकेनोस्टिम्यूलेशन
Summary
वर्तमान प्रोटोकॉल एक माइक्रोफ्लुइडिक प्रणाली के डिजाइन, निर्माण और लक्षण वर्णन का वर्णन करता है जो न्यूनतम उपयोगकर्ता हस्तक्षेप के साथ सैकड़ों ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर भ्रूणों को संरेखित करने, गतिहीन करने और ठीक से संपीड़ित करने में सक्षम है। यह प्रणाली पोस्ट-उत्तेजना विश्लेषण के लिए उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग और नमूनों की वसूली को सक्षम करती है और इसे अन्य बहुकोशिकीय जैविक प्रणालियों को समायोजित करने के लिए बढ़ाया जा सकता है।
Abstract
भ्रूणजनन के दौरान, समन्वित कोशिका आंदोलन यांत्रिक बल उत्पन्न करता है जो जीन अभिव्यक्ति और गतिविधि को नियंत्रित करता है। इस प्रक्रिया का अध्ययन करने के लिए, पूरे भ्रूण को यांत्रिक रूप से उत्तेजित करने के लिए आकांक्षा या कवरस्लिप संपीड़न जैसे उपकरणों का उपयोग किया गया है। ये दृष्टिकोण प्रयोगात्मक डिजाइन को सीमित करते हैं क्योंकि वे गलत हैं, मैनुअल हैंडलिंग की आवश्यकता होती है, और एक साथ केवल कुछ भ्रूणों को संसाधित कर सकते हैं। माइक्रोफ्लुइडिक सिस्टम में थ्रूपुट और परिशुद्धता को बढ़ाते हुए ऐसे प्रयोगात्मक कार्यों को स्वचालित करने की बहुत क्षमता है। यह लेख पूरे ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर (फ्रूट फ्लाई) भ्रूण को ठीक से संपीड़ित करने के लिए विकसित एक माइक्रोफ्लुइडिक प्रणाली का वर्णन करता है। इस प्रणाली में वायवीय रूप से सक्रिय विकृत साइडवॉल के साथ माइक्रोचैनल हैं और भ्रूण संरेखण, स्थिरीकरण, संपीड़न और पोस्ट-उत्तेजना संग्रह को सक्षम बनाता है। इन माइक्रोचैनलों को सात लेन में समानांतर करके, स्थिर या गतिशील संपीड़न पैटर्न को एक साथ सैकड़ों ड्रोसोफिला भ्रूणों पर लागू किया जा सकता है। ग्लास कवरस्लिप पर इस प्रणाली को बनाने से उच्च-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोप के साथ नमूनों की एक साथ यांत्रिक उत्तेजना और इमेजिंग की सुविधा मिलती है। इसके अलावा, पीडीएमएस जैसी जैव संगत सामग्री का उपयोग, और सिस्टम के माध्यम से तरल पदार्थ प्रवाह करने की क्षमता इस उपकरण को मीडिया-निर्भर नमूनों के साथ दीर्घकालिक प्रयोगों में सक्षम बनाती है। यह दृष्टिकोण मैनुअल माउंटिंग की आवश्यकता को भी समाप्त करता है जो यांत्रिक रूप से नमूने पर जोर देता है। इसके अलावा, माइक्रोचैनल्स से नमूने जल्दी से एकत्र करने की क्षमता पोस्ट-उत्तेजना विश्लेषण को सक्षम करती है, जिसमें -ओमिक्स परख शामिल हैं, जिन्हें पारंपरिक यांत्रिक उत्तेजना दृष्टिकोण का उपयोग करके बड़ी नमूना संख्या की आवश्यकता होती है। इस प्रणाली की ज्यामिति विभिन्न जैविक प्रणालियों के लिए आसानी से स्केलेबल है, जिससे उच्च नमूना थ्रूपुट, यांत्रिक उत्तेजना या स्थिरीकरण और स्वचालित संरेखण सहित यहां वर्णित कार्यात्मक विशेषताओं से लाभ उठाने के लिए कई क्षेत्रों को सक्षम किया जा सकता है।
Introduction
जीवित प्रणालियां लगातार अपने जीवनकाल में विभिन्न यांत्रिक इनपुट का अनुभव औरप्रतिक्रिया करती हैं। मेकानोट्रांसडक्शन को कई बीमारियों से जोड़ा गया है, जिसमें विकास संबंधी विकार, मांसपेशियों और हड्डियों के नुकसान, औरयांत्रिक वातावरण से प्रत्यक्ष या अप्रत्यक्ष रूप से प्रभावित सिग्नलिंग मार्गों के माध्यम से न्यूरोपैथोलॉजी शामिल हैं। हालांकि, मेकेनोसेंसिटिव सिग्नलिंग मार्ग4 में यांत्रिक उत्तेजना3 द्वारा विनियमित जीन और प्रोटीन काफी हद तक अज्ञात रहते हैं, यांत्रिक विनियमन तंत्र के स्पष्टीकरण को रोकते हैं और पैथोलॉजिकल मेकेनोट्रांसडक्शन 6,7 से जुड़े रोगों के लिए आणविक लक्ष्यों की पहचान करते हैं। . संबंधित शारीरिक प्रक्रियाओं पर मेकेनोबायोलॉजी अध्ययनों को प्रोजेक्ट करने में एक सीमित कारक बरकरार बहुकोशिकीय जीवों के बजाय पारंपरिक संस्कृति व्यंजनों के साथ व्यक्तिगत कोशिकाओं का उपयोग कर रहा है। ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर (फ्रूट फ्लाई) जैसे मॉडल जीवों ने पशु विकास में शामिल जीन, सिग्नलिंग मार्ग और प्रोटीनको समझने में बहुत योगदान दिया है। फिर भी, मेकेनोबायोलॉजी अनुसंधान में ड्रोसोफिला और अन्य बहुकोशिकीय मॉडल जीवों का उपयोग प्रयोगात्मक उपकरणों के साथ चुनौतियों से बाधित हुआ है। तैयार करने, छंटाई, इमेजिंग, या विभिन्न उत्तेजनाओं को लागू करने के लिए पारंपरिक तकनीकों को ज्यादातर मैनुअल हेरफेर की आवश्यकता होती है; ये दृष्टिकोण समय लेने वाले हैं, विशेषज्ञता की आवश्यकता होती है, परिवर्तनशीलता पेश करते हैं, और प्रयोगात्मक डिजाइन और नमूना आकारको सीमित करते हैं। हाल ही में सूक्ष्म तकनीकी प्रगति बहुत उच्च थ्रूपुट और अत्यधिक नियंत्रित प्रयोगात्मक मापदंडों12,13,14 के साथ नवीन जैविक परख को सक्षम करने के लिए एक महान संसाधन है।
यह लेख पूरे ड्रोसोफिला भ्रूण15 (चित्रा 1) के सैकड़ों में एकअक्षीय संपीड़न के रूप में यांत्रिक उत्तेजना को संरेखित, गतिहीन और सटीक रूप से लागू करने के लिए एक उन्नत माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस के विकास का वर्णन करता है। ग्लास कवरस्लिप के साथ माइक्रोफ्लुइडिक सिस्टम के एकीकरण ने उत्तेजना के दौरान नमूनों के उच्च-रिज़ॉल्यूशन कॉन्फोकल इमेजिंग की अनुमति दी। माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस ने -ओमिक्स परख (चित्रा 2) चलाने के लिए उत्तेजना के बाद भ्रूण के तेजी से संग्रह को भी सक्षम किया। इस उपकरण के डिजाइन विचारों के स्पष्टीकरण, साथ ही नरम लिथोग्राफी और प्रयोगात्मक लक्षण वर्णन का उपयोग करके निर्माण, यहां वर्णित हैं। चूंकि इस तरह के उपकरण के सिलिकॉन वेफर मोल्ड को बनाने के लिए उच्च पहलू अनुपात (एआर) खाइयों (एआर >5) वाले बड़े क्षेत्रों पर मोटी फोटोरेसिस्ट (मोटाई >200 μm) की एक समान कोटिंग की आवश्यकता होती है, इसलिए इस विधि ने पारंपरिक फोटोलिथोग्राफिक मोल्ड फैब्रिकेशन प्रोटोकॉल को काफी संशोधित किया। इस तरह, इस विधि ने फोटोरेसिस्ट के हैंडलिंग, आसंजन, कोटिंग, पैटर्निंग और विकास की सुविधा प्रदान की। इसके अतिरिक्त, संभावित नुकसान और उनके समाधानों पर चर्चा की जाती है। अंत में, इस डिजाइन और निर्माण रणनीति की बहुमुखी प्रतिभा को ड्रोसोफिला अंडा कक्षों और मस्तिष्क ऑर्गेनोइड्स16 जैसे अन्य बहुकोशिकीय प्रणालियों का उपयोग करके प्रदर्शित किया गया था।
Protocol
Representative Results
Discussion
लेख एक माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस के विकास का वर्णन करता है जो स्वचालित रूप से संरेखित, गतिहीन और सैकड़ों पूरे ड्रोसोफिला भ्रूण के लिए यांत्रिक उत्तेजना को ठीक से लागू करता है। एक पतले ग्लास कवरस्लिप ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (सीएमएमआई-1946456), वायु सेना के वैज्ञानिक अनुसंधान कार्यालय (एफए 9550-18-1-0262), और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (आर01एजी06100501 ए 1) द्वारा समर्थित किया गया था; R21AR08105201A1)।
Materials
| 100 mL tri-cornered perforated plastic beakers with 60 mm Petri dishes | Fisher | 14-955-111B | Perferate with air holes |
| 100 mm P B <100> 0-100 500um SSP Test Grade Si Wafer | University Wafer | 452 | |
| Biopsy punches | Ted Pella | 15110 | |
| Bleach | Not brand specific | ||
| Blunt needle set | CML Supply | 901 | |
| Contact Mask Aligner | Quintel | Q4000 MA | |
| Cutting mat | Dahle | Vantage 10670 | size: 24" x 36" |
| Developer | Kayaku Advance Materials | SU-8 2000 | |
| Direct Write Lithographer | Heidelberg | MLA100 | |
| Dissecting microscope | Any commericailly availble dissecting microscope with transmitted light | ||
| Glass petri dish | Fisher | FB0875713A | |
| Glass slide | Warner Instruments | 64-0710 (CS-24/60) | |
| HMDS Vapor Prime Oven | Yes Engineering | YES-3TA | |
| NaCl | Not brand specific | ||
| Oven | Labnet | I5110A | |
| Paintbrush | Not brand specific | ||
| PDMS | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Photoresist | MicroChem | SU-8 2100 | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| Portable pressure source | hygger Quietest | HGD946 | |
| Pressure gauge | Cole-Parmer | EW-68950-25 | |
| Spin Coater | Laurell | WS-650-8B | |
| Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane (PFOCTS) | Sigma-Aldrich | 448931-10G | |
| Triton-X 100 | Fisher | AAA16046AP | |
| Tubing | Saint-Gobain | 02-587-1A | |
| Ultrasonic Cleaner | Cole-Parmer | UX-08895-05 | |
| Vacuum Pump | Cole-Parmer | EW-07164-87 |
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