Meccanostimolazione di organismi pluricellulari attraverso un sistema di compressione microfluidica ad alta produttività
Summary
Il presente protocollo descrive la progettazione, la fabbricazione e la caratterizzazione di un sistema microfluidico in grado di allineare, immobilizzare e comprimere con precisione centinaia di embrioni di Drosophila melanogaster con un intervento minimo da parte dell’utente. Questo sistema consente l’imaging ad alta risoluzione e il recupero di campioni per l’analisi post-stimolazione e può essere scalato per adattarsi ad altri sistemi biologici multicellulari.
Abstract
Durante l’embriogenesi, il movimento cellulare coordinato genera forze meccaniche che regolano l’espressione e l’attività genica. Per studiare questo processo, sono stati utilizzati strumenti come l’aspirazione o la compressione del coverslip per stimolare meccanicamente embrioni interi. Questi approcci limitano la progettazione sperimentale in quanto sono imprecisi, richiedono una manipolazione manuale e possono elaborare solo un paio di embrioni contemporaneamente. I sistemi microfluidici hanno un grande potenziale per automatizzare tali attività sperimentali, aumentando al contempo la produttività e la precisione. Questo articolo descrive un sistema microfluidico sviluppato per comprimere con precisione interi embrioni di Drosophila melanogaster (moscerino della frutta). Questo sistema è dotato di microcanali con pareti laterali deformabili azionate pneumaticamente e consente l’allineamento dell’embrione, l’immobilizzazione, la compressione e la raccolta post-stimolazione. Parallelizzando questi microcanali in sette corsie, i modelli di compressione stazionari o dinamici possono essere applicati a centinaia di embrioni di Drosophila contemporaneamente. La fabbricazione di questo sistema su un vetrino facilita la stimolazione meccanica simultanea e l’imaging di campioni con microscopi ad alta risoluzione. Inoltre, l’utilizzo di materiali biocompatibili, come il PDMS, e la capacità di far fluire il fluido attraverso il sistema rendono questo dispositivo capace di esperimenti a lungo termine con campioni dipendenti dai media. Questo approccio elimina anche la necessità di un montaggio manuale che sollecita meccanicamente i campioni. Inoltre, la capacità di raccogliere rapidamente campioni dai microcanali consente analisi post-stimolazione, compresi i saggi -omici che richiedono grandi numeri di campioni irraggiungibili utilizzando i tradizionali approcci di stimolazione meccanica. La geometria di questo sistema è facilmente scalabile a diversi sistemi biologici, consentendo a numerosi campi di beneficiare delle caratteristiche funzionali qui descritte, tra cui l’elevata produttività del campione, la stimolazione meccanica o l’immobilizzazione e l’allineamento automatico.
Introduction
I sistemi viventi sperimentano e rispondono costantemente a vari input meccanici per tutta la loro vita1. La meccanotrasduzione è stata collegata a molte malattie, tra cui disturbi dello sviluppo, perdita muscolare e ossea e neuropatologie attraverso vie di segnalazione direttamente o indirettamente influenzate dall’ambiente meccanico2. Tuttavia, i geni e le proteine che sono regolati dalla stimolazione meccanica3 nelle vie di segnalazione meccanosensibili4 rimangono in gran parte sconosciuti5, impedendo la delucidazione dei meccanismi di regolazione meccanica e l’identificazione di bersagli molecolari per le malattie associate alla meccanotrasduzione patologica 6,7 . Un fattore limitante nel proiettare gli studi di meccanobiologia sui processi fisiologici correlati è l’utilizzo di singole cellule con piatti di coltura convenzionali invece di organismi multicellulari intatti. Organismi modello, come Drosophila melanogaster (moscerino della frutta), hanno contribuito notevolmente alla comprensione dei geni, delle vie di segnalazione e delle proteine coinvolte nello sviluppo animale 8,9,10. Tuttavia, l’uso di Drosophila e di altri organismi modello multicellulari nella ricerca meccanobiologica è stato ostacolato da sfide con strumenti sperimentali. Le tecniche convenzionali per la preparazione, l’ordinamento, l’imaging o l’applicazione di vari stimoli richiedono principalmente una manipolazione manuale; Questi approcci richiedono tempo, richiedono esperienza, introducono variabilità e limitano il disegno sperimentale e la dimensione del campione11. I recenti progressi microtecnologici sono una grande risorsa per consentire nuovi saggi biologici con un rendimento molto elevato e parametri sperimentali altamente controllati12,13,14.
Questo articolo descrive lo sviluppo di un dispositivo microfluidico potenziato per allineare, immobilizzare e applicare con precisione la stimolazione meccanica sotto forma di compressione uniassiale a centinaia di embrioni interi di Drosophila 15 (Figura 1). L’integrazione del sistema microfluidico con un vetrino di vetro ha permesso l’imaging confocale ad alta risoluzione dei campioni durante la stimolazione. Il dispositivo microfluidico ha anche permesso una rapida raccolta degli embrioni dopo la stimolazione per l’esecuzione di saggi -omici (Figura 2). Le spiegazioni delle considerazioni di progettazione di questo dispositivo, nonché la fabbricazione mediante litografia morbida e caratterizzazione sperimentale, sono descritte nel presente documento. Poiché la realizzazione di uno stampo per wafer di silicio di tale dispositivo richiede un rivestimento uniforme di fotoresist spesso (spessore >200 μm) su ampie aree con trincee ad alto rapporto di aspetto (AR) (AR >5), questo metodo ha modificato considerevolmente il tradizionale protocollo di fabbricazione di stampi fotolitografici. In questo modo, questo metodo ha facilitato la manipolazione, l’adesione, il rivestimento, il pattern e lo sviluppo del fotoresist. Inoltre, vengono discusse le potenziali insidie e le loro soluzioni. Infine, la versatilità di questa strategia di progettazione e fabbricazione è stata dimostrata utilizzando altri sistemi multicellulari come camere d’uovo di Drosophila e organoidi cerebrali16.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’articolo descrive lo sviluppo di un dispositivo microfluidico per allineare automaticamente, immobilizzare e applicare con precisione la stimolazione meccanica a centinaia di embrioni interi di Drosophila . L’integrazione del sistema microfluidico con un sottile vetrino di copertura ha permesso l’imaging degli embrioni con microscopia confocale ad alta risoluzione durante la stimolazione. Il dispositivo microfluidico ha anche permesso la raccolta degli embrioni subito dopo la stimolazione per l’esecuzione di s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato dalla National Science Foundation (CMMI-1946456), dall’Air Force Office of Scientific Research (FA9550-18-1-0262) e dal National Institute of Health (R01AG06100501A1; R21AR08105201A1).
Materials
| 100 mL tri-cornered perforated plastic beakers with 60 mm Petri dishes | Fisher | 14-955-111B | Perferate with air holes |
| 100 mm P B <100> 0-100 500um SSP Test Grade Si Wafer | University Wafer | 452 | |
| Biopsy punches | Ted Pella | 15110 | |
| Bleach | Not brand specific | ||
| Blunt needle set | CML Supply | 901 | |
| Contact Mask Aligner | Quintel | Q4000 MA | |
| Cutting mat | Dahle | Vantage 10670 | size: 24" x 36" |
| Developer | Kayaku Advance Materials | SU-8 2000 | |
| Direct Write Lithographer | Heidelberg | MLA100 | |
| Dissecting microscope | Any commericailly availble dissecting microscope with transmitted light | ||
| Glass petri dish | Fisher | FB0875713A | |
| Glass slide | Warner Instruments | 64-0710 (CS-24/60) | |
| HMDS Vapor Prime Oven | Yes Engineering | YES-3TA | |
| NaCl | Not brand specific | ||
| Oven | Labnet | I5110A | |
| Paintbrush | Not brand specific | ||
| PDMS | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Photoresist | MicroChem | SU-8 2100 | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| Portable pressure source | hygger Quietest | HGD946 | |
| Pressure gauge | Cole-Parmer | EW-68950-25 | |
| Spin Coater | Laurell | WS-650-8B | |
| Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane (PFOCTS) | Sigma-Aldrich | 448931-10G | |
| Triton-X 100 | Fisher | AAA16046AP | |
| Tubing | Saint-Gobain | 02-587-1A | |
| Ultrasonic Cleaner | Cole-Parmer | UX-08895-05 | |
| Vacuum Pump | Cole-Parmer | EW-07164-87 |
References
- Wang, J. H. -. C., Thampatty, B. P. An introductory review of cell mechanobiology. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 5 (1), 1-16 (2006).
- Ingber, D. Mechanobiology and diseases of mechanotransduction. Annals of Medicine. 35 (8), 564-577 (2003).
- Nims, R. J., Pferdehirt, L., Guilak, F. Mechanogenetics: Harnessing mechanobiology for cellular engineering. Current Opinion in Biotechnology. 73, 374-379 (2022).
- Bellin, R. M., et al. Defining the Role of Syndecan-4 in Mechanotransduction using Surface-Modification Approaches. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 22102-22107 (2009).
- Simpson, L. J., Reader, J. S., Tzima, E. Mechanical regulation of protein translation in the cardiovascular system. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 34 (2020).
- Humphrey, J. D., Schwartz, M. A. Vascular mechanobiology: Homeostasis, adaptation, and disease. Annual Review of Biomedical Engineering. 23, 1-27 (2021).
- Maurer, M., Lammerding, J. The driving force: Nuclear mechanotransduction in cellular function, fate, and disease. Annual Review of Biomedical Engineering. 21, 443-468 (2019).
- Jennings, B. H. Drosophila-A versatile model in biology & medicine. Materials Today. 14 (5), 190-195 (2011).
- Konno, M., et al. State-of-the-art technology of model organisms for current human medicine. Diagnostics. 10 (6), 392 (2020).
- Morgan, T. H. Sex limited inheritance in Drosophila. Science. 32 (812), 120-122 (1910).
- Wu, Q., Kumar, N., Velagala, V., Zartman, J. J. Tools to reverse-engineer multicellular systems: Case studies using the fruit fly. Journal of Biological Engineering. 13 (1), 1-16 (2019).
- Jayamohan, H., et al., Patrinos, G., et al. Chapter 11 – Advances in Microfluidics and Lab-on-a-Chip Technologies. Molecular Diagnostics. , 197-217 (2017).
- Scheler, O., Postek, W., Garstecki, P. Recent developments of microfluidics as a tool for biotechnology and microbiology. Current Opinion in Biotechnology. 55, 60-67 (2019).
- Mohammed, D., et al. Innovative tools for mechanobiology: Unraveling outside-in and inside-out mechanotransduction. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 162 (2019).
- Shorr, A. Z., Sönmez, U. M., Minden, J. S., LeDuc, P. R. High-throughput mechanotransduction in Drosophila embryos with mesofluidics. Lab on a Chip. 19 (7), 1141-1152 (2019).
- Kim, Y. T., et al. Mechanochemical Actuators of Embryonic Epithelial Contractility. Proceedings of the National Academy of Sciences. 40, 14366-14371 (2014).
- Ashburner, M. . Drosophila. A Laboratory Handbook. , (1989).
- Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro-and nanoscale patterning. Nature Protocols. 5 (3), 491 (2010).
- Lee, H., et al. A new fabrication process for uniform SU-8 thick photoresist structures by simultaneously removing edge bead and air bubbles. Journal of Micromechanics and Microengineering. 21 (12), 125006 (2011).
- Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography. Annual Review of Materials Science. 28 (1), 153-184 (1998).
- Sonmez, U. M., Coyle, S., Taylor, R. E., LeDuc, P. R. Polycarbonate heat molding for soft lithography. Small. 16 (16), 2000241 (2020).
- Levario, T. J., Zhan, M., Lim, B., Shvartsman, S. Y., Lu, H. Microfluidic trap array for massively parallel imaging of Drosophila embryos. Nature Protocols. 8 (4), 721-736 (2013).
