Drosophila melanogaster larva yağ gövdesinde açlığa bağlı otofajinin analizi
Summary
Bu protokol, Drosophila melanogaster larva yağ gövdesinde otofajinin besin tükenmesi yoluyla indüklenmesini açıklamakta ve transgenik sinek suşlarını kullanarak otofajideki değişiklikleri analiz etmektedir.
Abstract
Otofaji, hücresel bir kendi kendine sindirim sürecidir. Açlık da dahil olmak üzere çeşitli streslere yanıt olarak bozunma için lizozomlara kargo gönderir. Otofajinin arızalanması yaşlanma ve çoklu insan hastalıkları ile ilişkilidir. Otofaji makinesi, mayadan insanlara kadar yüksek oranda korunmaktadır. Omurgalı karaciğeri ve yağ dokusu için bir analog olan Drosophila melanogaster’in larva yağ gövdesi, in vivo otofajiyi izlemek için benzersiz bir model sağlar. Otofaji, larva yağ gövdesindeki besin açlığı ile kolayca indüklenebilir. Otofaji ile ilişkili genlerin çoğu Drosophila’da korunur. Etiketli otofaji belirteçlerini ifade eden birçok transgenik sinek suşu geliştirilmiştir, bu da otofaji sürecindeki farklı adımların izlenmesini kolaylaştırır. Klonal analiz, aynı doku parçasında farklı genotiplere sahip hücrelerdeki otofaji belirteçlerinin yakından karşılaştırılmasını sağlar. Mevcut protokol, (1) larva yağ gövdesinde somatik klonlar üretmek, (2) amino asit açlığı yoluyla otofajiyi indüklemek ve (3) larva yağ gövdesini diseke etmek, otofaji farklılıklarını bir otofagozom belirteci (GFP-Atg8a) ve klonal analiz kullanarak analiz etmek için bir model oluşturmayı amaçlayan prosedürleri detaylandırmaktadır.
Introduction
Otofaji, amino asit açlığı1 dahil olmak üzere çeşitli streslerin neden olduğu “kendi kendine yeme” sürecidir. Makrootofaji (bundan böyle otofaji olarak anılacaktır) en iyi çalışılmış otofaji türüdür ve hücresel homeostazın korunmasında yeri doldurulamaz bir rol oynar2. Otofajinin arızalanması çeşitli insan hastalıkları ile ilişkilidir3. Ek olarak, otofaji ile ilişkili bazı genler çeşitli hastalıkların tedavisinde potansiyel hedeflerdir4.
Otofaji son derece sofistike bir şekilde düzenlenir5. Açlıktan öldükten sonra, izolasyon membranları çift membranlı otofagozomlar oluşturmak için sitoplazmik materyalleri ayırır6. Otofagozomlar daha sonra amfizomlar ve otolizozomlar oluşturmak için endozomlar ve lizozomlarla kaynaşır. Lizozomal hidrolitik enzimlerin yardımıyla, yutulan sitoplazmik içerikler parçalanır ve besinler geri dönüştürülür7.
Otofaji evrimsel olarak korunmuş bir süreçtir8. Drosophila melanogaster, in vivo otofaji sürecini incelemek için harika bir modeldir. Amino asit açlığı, insan karaciğeri ve yağ dokusunun bir analoğu olan sinek yağ vücut dokusunda otofajiyi kolayca indükler9. Otofajideki kusurlar, diğerlerinin yanı sıra Atg8, Atg9, Atg18, Syx17, Rab7, LAMP1 ve p62 gibi otofaji ile ilişkili çeşitli proteinlerin farklı punkta paternlerini bozar10. Bu nedenle, bu otofaji belirteçlerinin paternlerini analiz etmek, otofaji defektlerinin oluşumunu ve kusurlu otofaji basamağını ayırt etmeye yardımcı olacaktır. Örneğin, ubikitin benzeri protein Atg8, en yaygın kullanılan otofaji belirteci11’dir. Drosophila melanogaster’de, yeşil floresan protein (GFP) etiketli Atg8a içeren transgenik suşlar başarıyla geliştirilmiştir12. GFP-Atg8a, beslenen hücrelerdeki sitosol ve çekirdeklerde yayılır. Açlıktan ölmek üzere, GFP-Atg8a fosfatidiletanolamin (PE) tarafından işlenir ve modifiye edilir ve izolasyon membranlarını ve tamamen gelişmiş otofagozomları13,14 etiketleyen punkta oluşturur. Doğrudan floresan mikroskopi ile otofaji indüksiyonu, GFP-Atg8 punkta oluşumu15’te bir artış olarak kolayca gözlemlenebilir. Atg8a puncta, otofaji başlatma defekti varlığında açlığa yanıt olarak oluşmaz. GFP-Atg8a, otolizozomlardaki düşük pH ile söndürülüp sindirilebildiğinden, otofaji geç evrelerde16’da bloke edilirse, GFP-Atg8a puncta sayıları artabilir.
Otofaji beslenme mevcudiyetine karşı oldukça hassas olduğu için17, kültür koşullarındaki küçük farklılıklar genellikle fenotiplerde farklılıklara yol açar. Bu nedenle, aynı dokudaki vahşi tip kontrol hücrelerine karşı mutant hücreleri analiz eden bir yöntem olan klonal analiz, otofaji defektlerinin diseksiyonunda büyük bir avantaja sahiptir18. Homolog kromozomlar arasındaki flippas / flippase tanıma hedefi (FLP / FRT) aracılı bölgeye özgü rekombinasyondan yararlanarak, mozaik dokuları taşıyan sinekler kolayca19,20 yapılır. Mutant hücreleri çevreleyen vahşi tip hücreler, bireysel farklılıkları önlemek için mükemmel bir iç kontrol oluşturur21.
Bu çalışma, amino asit açlığı ile otofajinin nasıl indükleneceğini ve GFP-Atg8a eksprese eden mozaik yağ vücut dokularının nasıl üretileceğini açıklamaktadır. Bu protokoller, mutant klonlar arasındaki otofajideki farklılıkları analiz etmek için kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mevcut protokol, (1) larva yağ cisimlerinde mutant klonlar taşıyan sinekler üretmek, (2) amino asit açlığı yoluyla otofajiyi indüklemek ve (3) larva yağ cisimleri diseke etmek için yöntemleri açıklamaktadır. Larva yağ gövdelerinde klonları başarılı bir şekilde üretmek için, aşağıdaki kritik adımların özenle gerçekleştirilmesi gerekir. (1) Isı şokunun doğru bir şekilde zamanlaması çok önemlidir, çünkü mitotik rekombinasyon sadece doku mitoz geçirdiğinde gerçekleşir ve (2) hem …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Sinek suşlarını sağladıkları için THFC ve BDSC’ye minnettarız. Dr. Tong Chao, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (32030027, 91754103, 92157201) ve merkezi üniversiteler için Temel araştırma fonları tarafından desteklenmektedir. Yaşam Bilimleri Enstitüsü’ndeki (LSI) çekirdek tesise hizmet verdiği için teşekkür ederiz.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | |
| #5 Forceps | Dumont | RS-5015 | |
| 9 Dressions Spot plate | PYREX | 7220-85 | |
| Fluorescence Microscope | Nikon | SMZ1500 | |
| Glycerol | Sangon Biotech | A100854-0100 | |
| KCl | Sangon Biotech | A610440-0500 | Composition of 1x PBS solution |
| KH2PO4 | Sangon Biotech | A600445-0500 | Composition of 1x PBS solution |
| Laboratory spatula | Fisher | 14-375-10 | |
| Long forceps | R' DEER | RST-14 | |
| Microscope cover glass | CITOTEST | 80340-1130 | |
| Microscope slides | CITOTEST | 80302-2104 | |
| Na2HPO4 | Sangon Biotech | A501727-0500 | Composition of 1x PBS solution |
| NaCl | Sangon Biotech | A610476-0005 | Composition of 1x PBS solution |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Petri dish | Corning | 430166 | |
| Standard cornmeal/molasses/agar fly food | Tong Lab-made | ||
| Stereo microscope | Nikon | SMZ745 | |
| Sucrose | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd. | 10021418 | |
| Vectashield antifade mounting medium with DAPI | Vectorlabratory | H-1200-10 | Recommended mounting medium |
| Fly stocks | |||
| y'w* Iso FRT19A | Tong Lab's fly stocks | ||
| y'w* Mu1FRT19A/ FM7,Kr GFP | Tong Lab's fly stocks | ||
| y'w* Mu2 FRT19A/ FM7,Kr GFP | Tong Lab's fly stocks | ||
| hsFLP ubiRFP FRT19A; cgGal4 UAS-GFP-Atg8a | Tong Lab's fly stocks |
References
- Yorimitsu, T., Klionsky, D. J. Autophagy: Molecular machinery for self-eating. Cell Death & Differentiation. 12 (2), 1542-1552 (2005).
- Jin, S., White, E. Role of autophagy in cancer: Management of metabolic stress. Autophagy. 3 (1), 28-31 (2007).
- Mizushima, N., Levine, B. Autophagy in human diseases. New England Journal of Medicine. 383 (16), 1564-1576 (2020).
- Mizushima, N., et al. Autophagy fights disease through cellular self-digestion. Nature. 451 (7182), 1069-1075 (2008).
- Yang, Z., Klionsky, D. J. Eaten alive: A history of macroautophagy. Nature Cell Biology. 12 (9), 814-822 (2010).
- Lamb, C. A., Yoshimori, T., Tooze, S. A. The autophagosome: Origins unknown, biogenesis complex. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 759-774 (2013).
- Klionsky, D. J., Eskelinen, E. L., Deretic, V. Autophagosomes, phagosomes, autolysosomes, phagolysosomes, autophagolysosomes…Wait,I’mconfused. Autophagy. 10 (4), 549-551 (2014).
- Zhang, S., Hama, Y., Mizushima, N. The evolution of autophagy proteins-Diversification in eukaryotes and potential ancestors in prokaryotes. Journal of Cell Science. 134 (13), (2021).
- Scott, R. C., Schuldiner, O., Neufeld, T. P. Role and regulation of starvation-induced autophagy in the Drosophila fat body. Developmental Cell. 7 (2), 167-178 (2004).
- Liu, W., et al. Mitochondrial protein import regulates cytosolic protein homeostasis and neuronal integrity. Autophagy. 14 (8), 1293-1309 (2018).
- Ichimura, Y., et al. A ubiquitin-like system mediates protein lipidation. Nature. 408 (6811), 488-492 (2000).
- Rusten, T. E., et al. Programmed autophagy in the Drosophila fat body is induced by ecdysone through regulation of the PI3K pathway. Developmental Cell. 7 (2), 179-192 (2004).
- Nishida, Y., et al. Discovery of Atg5/Atg7-independent alternative macroautophagy. Nature. 461 (7264), 654-658 (2009).
- Ravikumar, B., et al. Regulation of mammalian autophagy in physiology and pathophysiology. Physiological Reviews. 90 (4), 1383-1435 (2010).
- Xie, Z., Nair, U., Klionsky, D. J. Atg8 controls phagophore expansion during autophagosome formation. Molecular Biology of the Cell. 19 (8), 3290-3298 (2008).
- Shintani, T., Klionsky, D. J. Cargo proteins facilitate the formation of transport vesicles in the cytoplasm to vacuole targeting pathway. Journal of Biological Chemistry. 279 (29), 29889-29894 (2004).
- Russell, R. C., Yuan, H. X., Guan, K. L. Autophagy regulation by nutrient signaling. Cell Research. 24 (1), 42-57 (2014).
- Nagy, P., et al. How and why to study autophagy in Drosophila: It’s more than just a garbage chute. Methods. 75, 151-161 (2015).
- Golic, K. G., Lindquist, S. The FLP recombinase of yeast catalyzes site-specific recombination in the Drosophila genome. Cell. 59 (3), 499-509 (1989).
- Senecoff, J. F., Cox, M. M. Directionality in FLP protein-promoted site-specific recombination is mediated by DNA-DNA pairing. Journal of Biological Chemistry. 261 (16), 7380-7386 (1986).
- Germani, F., Bergantinos, C., Johnston, L. A. Mosaic analysis in Drosophila. 유전학. 208 (2), 473-490 (2018).
- Zappia, M. P., et al. E2F/Dp inactivation in fat body cells triggers systemic metabolic changes. eLife. 10, 67753 (2021).
- Demerec, M. . Biology of Drosophila. , (1965).
- Rizki, R. M., et al. Drosophila larval fat body surfaces. Wilhelm Roux’s Archives of Developmental Biology. 192 (1), 1-7 (1983).
- Szeto, J., et al. ALIS are stress-induced protein storage compartments for substrates of the proteasome and autophagy. Autophagy. 2 (3), 189-199 (2006).
- Renna, M., et al. Chemical inducers of autophagy that enhance the clearance of mutant proteins in neurodegenerative diseases. Journal of Biological Chemistry. 285 (15), 11061-11067 (2010).
- Guo, S., et al. A large-scale RNA interference screen identifies genes that regulate autophagy at different stages. Scientific Reports. 8, 1-15 (2018).
- Tian, W., et al. An antibody for analysis of autophagy induction. Nature Methods. 17 (2), 232-239 (2020).
- Nezis, I. P. Selective autophagy in Drosophila. International Journal of Cell Biology. 2012, 146767 (2012).
- Chu, Y., et al. Fluorescent materials for monitoring mitochondrial biology. Materials. 14 (15), 4180 (2021).
