太平洋水母干细胞样细胞的荧光原位杂交和5-乙炔基-2'-脱氧尿苷标记
Summary
在这里，我们描述了一种用于可视化水母 Cladonema中干细胞样增殖细胞的协议。与干细胞标记物的全安装荧光 原位 杂交可以检测干细胞样细胞，5-乙炔基-2′-脱氧尿苷标记可以鉴定增殖细胞。一起，可以检测到活跃增殖的干细胞样细胞。
Abstract
刺胞动物，包括海葵、珊瑚和水母，表现出不同的形态和生活方式，表现为无柄息肉和自由游泳的美杜莎。正如 在Hydra 和 Nematostella等已建立的模型中的例子，干细胞和/或增殖细胞有助于刺胞珊瑚虫的发育和再生。然而，大多数水母的潜在细胞机制，特别是在美杜莎阶段，在很大程度上尚不清楚，因此，开发一种用于识别特定细胞类型的稳健方法至关重要。本文描述了一种可视化水生动物水母 Cladonema pacificum 中干细胞样增殖细胞的方案。 Cladonema medusae拥有分枝触手，在整个成虫阶段不断生长并保持再生能力，为研究增殖和/或干细胞样细胞协调的细胞机制提供了一个独特的平台。使用干细胞标记物的全安装荧光 原位 杂交（FISH）可以检测干细胞样细胞，而使用S相标记物5-乙炔基-2′-脱氧尿苷（EdU）进行脉冲标记可以鉴定增殖细胞。结合FISH和EdU标记，我们可以检测固定动物上活跃增殖的干细胞样细胞，并且该技术可以广泛应用于其他动物，包括非模型水母物种。
Introduction
刺胞动物被认为是一种基部分支的后生动物门，包含具有神经和肌肉的动物，使它们处于了解动物发育和生理学进化的独特位置1，2。刺胞动物分为两大类：花生动物（例如海葵和珊瑚）仅拥有扁平幼虫和无柄息肉阶段，而Medusozoa（水生动物，Staurozoa，Scyphozoa和Cubozoa的成员）通常采取自由游泳的水母或水母的形式，以及扁平幼虫和息肉。刺胞动物通常表现出很高的再生能力，其潜在的细胞机制，特别是它们拥有成体干细胞和增殖细胞，引起了人们的广泛关注3，4。最初在Hydra中鉴定，水生干细胞位于外胚层上皮细胞之间的间质空间中，通常称为间质细胞或i细胞3。
水生动物i细胞具有共同的特征，包括多能性，广泛保守的干细胞标志物（例如，纳米，Piwi，Vasa）的表达和迁移潜力3，5，6，7，8。作为功能性干细胞，i细胞广泛参与水生动物的发育、生理和环境反应，这证明了它们的高再生能力和可塑性3。虽然干细胞与i细胞相似，尚未在水生动物之外发现，即使在已建立的模式物种Nematostella中，增殖细胞仍然参与体细胞组织的维持和再生以及生殖系9。由于刺胞动物发育和再生的研究主要在息肉型动物（如Hydra，Hydractinia和Nematostella）上进行，因此水母物种中干细胞的细胞动力学和功能在很大程度上仍未得到解决。
水生动物水母 Clytia hemisphaerica是一种 世界性水母物种，在世界各地（包括地中海和北美）具有不同的栖息地，已在几项发育和进化研究中被用作实验模型动物10。 Clytia 体积小、易于处理、卵大，适用于实验室维护，以及引入遗传工具，例如最近建立的转基因和敲除方法11，为详细分析水母生物学背后的细胞和分子机制提供了机会。在 Clytia medusa 触手中，i细胞位于称为球茎的近端区域，线虫等祖细胞迁移到远端尖端，同时分化成不同的细胞类型，包括线细胞12。
在水母的口腔器官Clytia manubrium的再生过程中，存在于性腺中的Nanos1 + i细胞迁移到手稿因损伤而丢失的区域，并参与手稿的再生7。这些发现支持了Clytia中的i细胞也表现为参与形态发生和再生的功能性干细胞的观点。然而，鉴于i细胞的性质在具有代表性的息肉型动物（如Hydra和Hydractinia3）之间有所不同，因此干细胞的特征和功能可能在水母物种中多样化。此外，除了Clytia之外，其他水母的实验技术受到限制，增殖细胞和干细胞的详细动力学未知13。
水生动物水母 Cladonema pacificum 是一种新兴的模式生物，可以在没有水泵或过滤系统的情况下保存在实验室环境中。Cladonema medusa具有分支触手，这是 Cladonematidae 家族的共同特征，并且在灯泡14附近的外胚层上有一个称为ocellus的感光器官。触手分支过程发生在沿着触手的近轴侧出现的新分支部位。随着时间的流逝，触手继续伸长并分枝，较老的枝条被推向尖端15。此外， Cladonema 触手可以在截肢后的几天内再生。最近的研究表明增殖细胞和干细胞样细胞在 Cladonema16，17的触手分支和再生中的作用。然而，虽然传统的 原位 杂交（ISH）已被用于可视化 Cladonema中的基因表达，但由于其分辨率低，目前很难在细胞水平上详细观察干细胞动力学。
本文描述了一种通过FISH可视化Cladonema中的干细胞样细胞并与细胞增殖标志物EdU共染色的方法18。我们通过FISH可视化了干细胞标记5，17Nanos1的表达模式，这允许在单细胞水平上鉴定干细胞样细胞分布。此外，Nanos1表达与EdU标记的共染色使得区分活跃增殖的干细胞样细胞成为可能。这种监测干细胞样细胞和增殖细胞的方法可以应用于广泛的研究领域，包括触手分支、组织稳态和克拉多内玛的器官再生，类似的方法可以应用于其他水母物种。
Protocol
Representative Results
Discussion
增殖细胞和干细胞是形态发生、生长和再生等各种过程中的重要细胞来源21，22。本文描述了一种通过FISH和EdU标记在水母乳中对干细胞标记物Nanos1进行共染色的方法。先前使用EdU或BrdU标记的工作表明，增殖细胞定位于触手球16，17，但它们的分子特征尚不清楚。本研究显示了增殖细胞分布和Nano…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了AMED的支持，授权号为JP22gm6110025（致Y.N.）和JSPS KAKENHI资助号为22H02762（致Y.N.）。
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Wako | 137-06862 | |
| 3.1 mL transfer pipette | Thermo Scientific | 233-20S | |
| 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal) | Wako | 029-15043 | |
| anti-DIG-POD | Roche | 11207733910 | |
| Cladonema pacificum Nanos1 forward primer | 5’-AAGAGACACAGTCATTATCAAGC GA-3’ |
||
| Cladonema pacificum Nanos1 reverse primer | 5’-CGACGTGTCCAATTTTACGTGCT -3’ | ||
| Cladonema pacificum Piwi forward primer | 5’- AAAAGAGCAGCGGCCAGAAAGA AGGC -3’ |
||
| Cladonema pacificum Piwi reverse primer | 5’- GCGGGTCGCATACTTGTTGGTA CTGGC -3’ |
||
| Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 488 dye | Invitrogen | C10337 | EdU kit |
| Coroline off | GEX Co. ltd | N/A | chlorine neutralizer |
| DIG Nucleic Acid Detection Kit Blocking Reagent | Roche | 11175041910 | blocking buffer |
| DIG RNA labeling mix | Roche | 11277073910 | |
| DTT | Promega | P117B | |
| ECOS competent cell DH5α | NIPPON GENE | 316-06233 | competent cell |
| Fast gene Gel/PCR Extraction kit | Fast gene | FG-91302 | gel extraction kit |
| Fast gene plasmid mini kit | Fast gene | FG-90502 | plasmid miniprep |
| Formamide | Wako | 068-00426 | |
| Heparin sodium salt from porcine | SIGMA-ALDRICH | H3393-10KU | |
| Isopropyl-β-D(-)-thiogalactopyranoside (IPTG) | Wako | 096-05143 | |
| LB Agar | Invitrogen | 22700-025 | agar plate |
| LB Broth Base | Invitrogen | 12780-052 | LB medium |
| Maleic acid | Wako | 134-00495 | |
| mini Quick spin RNA columns | Roche | 11814427001 | clean-up column |
| NaCl | Wako | 191-01665 | |
| NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi | Thermo Scientific | ND-ONEC-W | spectrophotometer |
| Polyoxyethlene (20) Sorbitan Monolaurate (Tween-20) | Wako | 166-21115 | |
| PowerMasher 2 | nippi | 891300 | homogenizer |
| Proteinase K | Nacarai Tesque | 29442-14 | |
| RNase Inhibitor | TaKaRa | 2313A | |
| RNeasy Mini kit | Qiagen | 74004 | total RNA isolation kit |
| RQ1 RNase-Free Dnase | Promega | M6101 | |
| Saline Sodium Citrate Buffer 20x powder (20x SSC) | TaKaRa | T9172 | |
| SEA LIFE | Marin Tech | N/A | mixture of mineral salts |
| T3 RNA polymerase | Roche | 11031163001 | |
| T7 RNA polymerase | Roche | 10881767001 | |
| TAITEC HB-100 | TAITEC | 0040534-000 | Hybridization incuvator |
| TaKaRa Ex Taq | TaKaRa | RR001A | Taq DNA polymerase |
| TaKaRa PrimeScript 2 1st strand cDNA Synthesis Kit | TaKaRa | 6210A | cDNA synthesis kit |
| Target Clone | TOYOBO | TAK101 | pTA2 Vector |
| tRNA | Roche | 10109541001 | |
| TSA Plus Cyanine 5 | AKOYA Biosciences | NEL745001KT | tyramide signal amplification (TSA) technique |
| Zeiss LSM 880 | ZEISS | N/A | laser scanning confocal microscope |
References
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