תנאי ניסוי מותאמים לאובדן שמיעה כתוצאה מרעש בעכברים והערכת תפקוד השמיעה ונזק לתאי השערה החיצוניים
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור מודל עכבר של ליקוי שמיעה הנגרם על ידי רעש (NIHL). כדי ליצור את NIHL, פיתחנו מכשיר חדש ופשוט העשוי מפלסטיק גלי, כלוב מלכודת חולדות ורמקול. תגובת גזע המוח השמיעתי והדמיית אימונופלואורסצנטיות שימשו להערכת תפקוד השמיעה והנזק לתאי השערה החיצוניים, בהתאמה.
Abstract
מודל בעל חיים של ליקוי שמיעה הנגרם מרעש (NIHL) שימושי עבור פתולוגים, מטפלים, פרמקולוגים וחוקרי שמיעה כדי להבין לעומק את המנגנון של NIHL, ולאחר מכן לייעל את אסטרטגיות הטיפול המתאימות. מחקר זה נועד ליצור פרוטוקול משופר לפיתוח מודל עכבר של NIHL. במחקר זה נעשה שימוש בעכברי C57BL/6J זכרים. עכברים לא מורדמים נחשפו לרעשים חזקים (1 ו -6 קילוהרץ, שהוצגו בו זמנית ב 115-125 dB SPL-A) ברציפות במשך 6 שעות ביום במשך 5 ימים רצופים. תפקוד השמיעה הוערך יום ושבוע לאחר החשיפה לרעש, באמצעות תגובת גזע המוח השמיעתית (ABR). לאחר מדידת ABR, העכברים הוקרבו, ואיבריהם של קורטי נאספו עבור צביעה immunofluorescence. ממדידות התגובה השמיעתית של גזע המוח (ABR), נצפה ליקוי שמיעה משמעותי יום אחד לאחר החשיפה לרעש. לאחר שבוע אחד, סף השמיעה של עכברי הניסוי ירד ל~80 dB SPL, שעדיין היה רמה גבוהה משמעותית מעכברי הביקורת (~ 40 dB SPL). מתוצאות ההדמיה האימונופלואורסצנטית, תאי השערה החיצוניים (OHC) הוכחו כפגומים. לסיכום, יצרנו מודל של NIHL באמצעות עכברי C57BL/6J זכרים. מכשיר חדש ופשוט ליצירה והעברה של רעש צליל טהור פותח ולאחר מכן נעשה בו שימוש. מדידות כמותיות של ספי שמיעה ואישור מורפולוגי של נזקי OHC הראו שניהם כי הרעש המופעל גרם בהצלחה לאובדן שמיעה צפוי.
Introduction
כ-1.3 מיליארד אנשים ברחבי העולם סובלים מאובדן שמיעה כתוצאה מחשיפה לרעש1. במחקר זה, שאפנו לבסס תהליך ברור שלב אחר שלב לגרימת ואישור אובדן שמיעה הנגרם על ידי רעש (NIHL). NIHL נובע מניוון/הרס של תאי השערה (HCs) ונוירוני גנגליון ספירליים (SGNs), נזק בסטריאוסיליה של HC ו/או אובדן סינפסות בין HCs פנימיים של השבלול לבין SGNs. חריגות כאלה עלולות לגרום גם לטינטון ולפגיעה בתפיסת הדיבור (במיוחד בסביבה אקוסטית מורכבת) מלבד NIHL. תפקודים חברתיים, פסיכולוגיים וקוגניטיביים עשויים להיות מושפעים ברצף מליקויים פיזיולוגיים אלה 2,3,4,5,6.
במחקרים פרה-קליניים הקשורים ל-NIHL המבוססים על עכברים, זני העכבר הפופולריים ביותר הם CBA/CaJ 2,3,6,7 ו-C57BL/6 4,5,8. יתר על כן, העכברים הזכרים 3,4,7 נפוצים יותר מהנקבות, שכן לאסטרוגן יש השפעה מגנה על השמיעה. לכן, במחקר הזה השתמשנו רק בעכברים זכרים9. לאחר התייחסות לספרות, בחרנו 1 קילוהרץ ו 6 קילוהרץ כתדרים של הרעש המופעל. עוצמת הרעש שהופעל הייתה 115 dB SPL-A (המקיף את הכלוב) עד 125 dB SPL-A (במרכז הכלוב). לאחר חשיפת עכברי הניסוי לרעש ברציפות במשך 6 שעות ביום, במשך 5 ימים רצופים, עלייה אופטימלית בסף השמיעה הצביעה על היקף אופטימלי של NIHL שנוצר בעכברי הניסוי. הפעולות לטיפול בבעלי החיים, בניית מערך הניסוי וגרימת רעש מתוארות בבירור שלב אחר שלב בפרוטוקול שסופק.
Protocol
Representative Results
Discussion
ניתן לחלק את NIHL לשני סוגים: NIHL זמני, אשר מראה שינוי זמני של סף השמיעה, ו- NIHL קבוע, אשר מתבטא בשינוי סף שמיעה קבוע. ליקוי השמיעה שראינו ביוםהשישי (יום אחד לאחר החשיפה לרעש) הוא ככל הנראה שילוב של שני סוגים אלה. במקרה זה, סף השמיעה יראה התאוששות הדרגתית לאורך זמן בשל המרכיב הזמני של ליקוי שמ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים למענקים ממשרד המדע והטכנולוגיה (MOST) של ממשלת טייוואן (MOST 110-2314-B-715-005, MOST 111-2314-B-715-009-MY3), ולמענקי מחקר פנימיים מהמכללה הרפואית Mackay (MMC-RD-110-1B-P030, MMC-RD-111-CF-G002-03).
Materials
| 1/4" CCP Free-field Standard Microphone Set | GRAS | 428158 | For noise exposure |
| Amplifier Input Module, AMI100D | BIOPAC | For auditory brainstem response | |
| Bio-amplifier, BIO100C | BIOPAC | For auditory brainstem response | |
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | A9647 | Immunofluorescence staining |
| Cellsens software | Olympus life science | Image acquisition | |
| Corrugated plastic | |||
| DAPI fluoromount | SouthernBiotech | 0100-20 | Immunofluorescence staining |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | SIGMA | E5134 | Decalcification |
| Evoked Response Amplifier, ERS100C | BIOPAC | For auditory brainstem response | |
| Formaldehyde | APLHA | F030410 | Fixation of cochlear |
| High Performance Data Acquisition System, MP160 | BIOPAC | For auditory brainstem response | |
| Modular Extension Cable, MEC110C | BIOPAC | For auditory brainstem response | |
| Myo7A primary antibody | Proteus | 25-6790 | Immunofluorescence staining |
| Myo7A secondary antibody | Jackson immunoresearch | 711-545-152 | Immunofluorescence staining |
| Needle Electrode, Unipolar 12 mmTp, EL452 | BIOPAC | For auditory brainstem response | |
| phalloidin antibody | Alexa Fluor | A12381 | Immunofluorescence staining |
| phosphate-buffered saline | SIGMA | P4417 | |
| Rat trap cage | 14 cm x 17 cm x 24cm | ||
| ROMPUN- xylazine injection, solution | Bayer HealthCare, LLC | ||
| Sound amplifier, MT-1000 | unika | For noise exposure | |
| Sound generator/analyzer/miscellaneous, FW-02 | CLIO | 620300719 | For noise exposure |
| Soundproof chamber | IEA Electro-Acoustic Technology | For noise exposure and ABR | |
| Speaker | IEA Electro-Acoustic Technology | For noise exposure | |
| Stimulator Module, STM100C | BIOPAC | For auditory brainstem response | |
| Triton X-100 | SIGMA | T8787 | Immunofluorescence staining |
| Tubephone Set, OUT101 | BIOPAC | For auditory brainstem response | |
| Upright Microscope, BX53 | Olympus | Image acquisition | |
| Zoletil | Virbac |
References
- World Report on Hearing. World Health Organization Available from: https://www.who.int/publications/i/item/9789240020481 (2021)
- Fernandez, K. A., et al. Noise-induced cochlear synaptopathy with and without sensory cell loss. 신경과학. 427, 43-57 (2020).
- Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after "temporary" noise-induced hearing loss. The Journal of Neuroscience. 29 (45), 14077-14085 (2009).
- Wang, J., et al. Overexpression of X-linked inhibitor of apoptosis protein protects against noise-induced hearing loss in mice. Gene Therapy. 18 (6), 560-568 (2011).
- Takeda, S., Mannström, P., Dash-Wagh, S., Yoshida, T., Ulfendahl, M. Effects of aging and noise exposure on auditory brainstem responses and number of presynaptic ribbons in inner hair cells of C57BL/6J mice. Neurophysiology. 49 (5), 316-326 (2017).
- Rouse, S. L., Matthews, I. R., Li, J., Sherr, E. H., Chan, D. K. Integrated stress response inhibition provides sex-dependent protection against noise-induced cochlear synaptopathy. Scientific Reports. 10 (1), 18063 (2020).
- Amanipour, R. M., et al. Noise-induced hearing loss in mice: Effects of high and low levels of noise trauma in CBA mice. Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. 2018, 1210-1213 (2018).
- Edderkaoui, B., Sargsyan, L., Hetrick, A., Li, H. Deficiency of duffy antigen receptor for chemokines ameliorated cochlear damage from noise exposure. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 173 (2018).
- Hultcrantz, M., Simonoska, R., Stenberg, A. E. Estrogen and hearing: a summary of recent investigations. Acta Oto-laryngologica. 126 (1), 10-14 (2006).
- Tsai, S. C. -. S., et al. The intravenous administration of skin-derived mesenchymal stem cells ameliorates hearing loss and preserves cochlear hair cells in cisplatin-injected mice: SMSCs ameliorate hearing loss and preserve outer hair cells in mice. Hearing Research. 413, 108254 (2022).
- Choi, M. Y., Yeo, S. W., Park, K. H. Hearing restoration in a deaf animal model with intravenous transplantation of mesenchymal stem cells derived from human umbilical cord blood. Biochemical and Biophysical Research Communications. 427 (3), 629-636 (2012).
- Yu, S. -. K., et al. Morphological and functional evaluation of ribbon synapses at specific frequency regions of the mouse cochlea. Journal of Visualized Experiments. (147), e59189 (2019).
