心筋梗塞後の成体マウス心臓からのシングルセルRNAシーケンシングのための非心筋細胞懸濁液の調製
Summary
ここでは、心筋梗塞後(MI)マウスの心臓から十分な量の生存率の高い単一の非心筋細胞を単離するためのプロトコルについて説明します。これは、その後のシングルセルシーケンシング、フローサイトメトリー解析、および初代細胞培養に使用できます。
Abstract
心筋梗塞(MI)は最も一般的な心血管疾患の1つであり、世界中で死亡率が増加しています。非心筋細胞は全心筋細胞集団の半分以上を占め、炎症反応、組織修復、瘢痕形成など、心筋損傷時の適応補償に寄与しています。MI後の心臓微小環境を研究するために、シングルセルRNAシーケンシング(scRNA-seq)は、さまざまな心臓細胞タイプと細胞間コミュニケーションを同定するために広く使用されています。scRNA-seqサンプル調製の手順の中で、細胞生存率はscRNA-seq結果の品質に影響を与える可能性があるため、細胞懸濁液の調製は最も重要なステップの1つです。したがって、MI後のマウス心臓から非心筋細胞懸濁液を調製するための実験プロトコルを設計し、穏やかな消化酵素の選択、消化時間の制御、および蛍光活性化セルソーティング(FACS)の適用による細胞の生存率の向上に特に重点を置いています。最後に、このプロトコルで得られた非心筋細胞懸濁液からCD45+ 細胞を単離し、scRNA-seqを実行しました。
Introduction
心筋梗塞(MI)は最も一般的な心血管疾患の1つであり、その死亡率は世界中で増加しています1。MIは周囲の心筋への不十分な血液供給によって引き起こされ、これはアテローム硬化性プラーク破裂で起こる冠状動脈閉塞の結果である可能性があります。経皮的冠動脈インターベンション(PCI)は急性MI患者の死亡率を低下させましたが、MI後の心不全の高い有病率は依然として問題です2。MI後の心不全の根底にある重要な病態生理学は、心臓損傷に対する体の代償反応であり、これには、死んだ心筋を非収縮性線維性瘢痕に置き換えることが含まれます。これらの適応応答は、複数の細胞型と心臓組織細胞との間の相互作用によって媒介される局所炎症に大きく依存しており、この炎症は現在、線維性瘢痕形成を減少させ、したがってMI後の心不全から保護するための潜在的な治療標的と見なされています3,4。興味深いことに、梗塞部位の微小環境は、浸潤細胞の種類とMI 1,5のさまざまな段階で機能に時間依存的な遷移を経験します。多くの研究は、非心筋細胞(例えば、免疫細胞、線維芽細胞、および内皮細胞)が、MI後の炎症および組織修復において中心的な役割を果たすことを示している5,6。近年、シングルセルシーケンシングは、MI後の微小環境における非心筋細胞の関与と機能を解明するための強力なツールとして広く使用されています7,8。これは、MI後の損傷と修復の病態生理学、およびMI後の心不全に対する潜在的な治療法の開発への洞察を提供します。
ハイスループットRNAシーケンシング(RNA-Seq)は、次世代シーケンシング(NGS)7,8,9を使用してトランスクリプトーム全体を詳細に研究するために使用される技術です。最近、scRNA-Seqの開発は生物医学研究分野に革命をもたらしました。従来のバルクシーケンシングと比較して、scRNA-Seqは単一細胞レベルで遺伝子発現プロファイルと転写不均一性を分析します7,8。この技術は、MI後の微小環境における異なる循環細胞タイプを特定し、心筋細胞と非心筋細胞との間の相互作用を明らかにすることにより、MI 9,10の細胞病態生理学の研究を著しく促進する。これらの知見は、MI後心不全の新たな治療標的の解明にも貢献する。一般に、scRNA-seqベースのポストMI実験には、3つの主要なセクションが含まれます:(1)ポストMI動物モデルの確立;(2)細胞懸濁液の調製;(3)サンプルシーケンシングとデータ分析。注目すべきことに、細胞懸濁液の品質が結果の精度を決定するため、細胞懸濁液の調製はscRNA-Seq実験の調製において最も重要なステップです。
このプロトコルは、MI後の心臓組織から非心筋細胞懸濁液を抽出するように設計されています。重要なことに、細胞の生存率と分解能を維持するための特定の詳細が含まれています。一方、マウス用の外科キット、げっ歯類人工呼吸器、遠心分離機など、このプロトコルで使用される機器は、ほとんどの動物実験センターや生物医学研究所で見つけることができるため、このプロトコルの実験コストは比較的低くなっています。さらに、梗塞の時点と部位を変数として考慮する場合、このプロトコルは、特にMI後の合併症について、幅広い臨床シナリオをシミュレートするために適用できます。
Protocol
Representative Results
Discussion
この記事は、MI後のマウス心臓から単一の非心筋細胞を分離するためのプロトコルを説明することを目的としています。このプロトコルは、免疫細胞、内皮細胞、線維芽細胞など、MI後の微小環境におけるさまざまな種類の細胞を高品質で分離するために適用できます。シングルセルシーケンシング用の高品質の細胞懸濁液を得るためには、3つの重要な要素が重要です。1つ目は酵素消化の設?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、浙江省自然科学基金(LQ22H020010)の支援を受けました。
Materials
| Acridine Orange / Propidium Iodide Stain | Logos biosystems | F23001 | |
| Automated Cell Counter | Logos biosystems | L20001 | |
| Bovine Serum Albumin | Servicebio | G5001 | Cytoprotective effect |
| Cell Counting Slides | Logos biosystems | L12001 | |
| Collagenase Type IV | Gibco | 17104019 | Digestive enzymes |
| Dispase II | Sigma | D4693 | Digestive enzymes |
| Dnase I | Roche | 11284932001 | Prevent cell clumping |
| Falcon 40μm Cell Strainer | Falcon | 352340 | Remove cell clumps |
| Falcon 70μm Cell Strainer | Falcon | 352350 | Remove undigested tissue and clumps |
| Flow Cell Sorter | Beckman Coulter | B25982 | |
| Iodophor | OU QING SI | 10054963976859 | |
| Needle Holder | FST | 12061-01 | |
| Ophthalmic Forceps | RWD | F14012-10 | |
| Ophthalmic Scissors | RWD | S11036-08 | |
| Phosphate Buffered Saline | Servicebio | G4202-500ML | |
| RBC Lysis Buffer | Beyotime | C3702-120ml | Remove red blood cells |
| Rib Retractor | FST | 17005-04 | |
| Rodent Ventilator | Harvard | 730043 | |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 11875093 | Solvent solution of enzyme |
| Sterile Scissor | RWD | S14014-10 |
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