심근경색 후 성인 마우스 심장에서 단일 세포 RNA 시퀀싱을 위한 비심근세포 세포 현탁액의 제조

Summary

여기에서 우리는 심근 경색 후(MI) 마우스 심장에서 높은 생존력을 가진 충분한 양의 단일 비심근 세포를 분리하는 프로토콜을 설명합니다. 이는 후속 단일 세포 시퀀싱, 유세포 분석 및 일차 세포 배양에 사용할 수 있습니다.

Abstract

심근경색증(MI)은 전 세계적으로 사망률이 증가하고 있는 가장 흔한 심혈관 질환 중 하나입니다. 비심근세포는 전체 심장 세포 집단의 절반 이상을 차지하며 염증 반응, 조직 복구 및 흉터 형성을 포함하여 심근 손상 시 적응 보상에 기여합니다. MI 후 심장 미세 환경을 연구하기 위해 단일 세포 RNA 시퀀싱(scRNA-seq)은 다양한 심장 세포 유형과 세포 간 통신을 식별하는 데 널리 사용됩니다. scRNA-seq 샘플 준비 절차 중 세포 현탁액을 준비하는 것은 세포 생존율이 scRNA-seq 결과의 품질에 영향을 미칠 수 있기 때문에 가장 중요한 단계 중 하나입니다. 따라서 우리는 약한 소화 효소를 선택하고, 소화 시간을 제어하고, 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 적용하여 세포 생존율을 향상시키는 데 추가로 중점을 두고 MI 후 마우스 심장에서 비심근세포 세포 현탁액을 준비하기 위한 실험 프로토콜을 설계했습니다. 마지막으로, 우리는 이 프로토콜을 통해 얻은 비심근세포 세포 현탁액에서 CD45⁺ 세포를 분리한 다음 scRNA-seq를 수행했습니다.

Introduction

심근경색증(Myocardial infarction, MI)은 가장 흔한 심혈관 질환 중 하나이며, 전 세계적으로 그 사망률이 증가하고 있다¹. MI는 주변 심근으로의 혈액 공급이 불충분하여 발생하며, 이는 죽상동맥경화반 파열과 함께 발생하는 관상동맥 막힘의 결과일 수 있습니다. 경피적 관상동맥 중재술(PCI)이 급성 심근경색 환자의 사망률을 감소시켰지만, 심근경색 후 심부전의 높은 유병률은 여전히 문제로 남아 있다². MI 후 심부전의 기초가 되는 주요 병태생리학은 죽은 심장 근육을 비수축성 섬유성 흉터로 대체하는 것을 포함하는 심장 손상에 대한 신체의 보상 반응입니다. 이러한 적응 반응은 여러 세포 유형과 심장 조직 세포 사이의 상호 작용에 의해 매개되는 국소 염증에 크게 의존하며, 이 염증은 이제 섬유성 흉터 형성을 감소시켜 MI 후 심부전을 예방하기 위한 잠재적인 치료 표적으로 간주됩니다 ^3,4. 흥미롭게도, 경색 부위의 미세환경은 MI ^1,5의 상이한 단계에서 침윤 세포 유형 및 기능에서 시간 의존적 전이를 경험한다. 많은 연구에서 비심근세포(예: 면역 세포, 섬유아세포, 내피 세포)가 MI 후 염증 및 조직 복구에 중심적인 역할을 하는 것으로 나타났습니다 ^5,6. 최근 몇 년 동안, 단세포 시퀀싱은 MI 이후 미세 환경에서 비심근세포의 침범 및 기능을 설명하기 위한 강력한 도구로서 널리 사용되어 왔다 ^7,8_. 이것은 MI 후 손상 및 복구의 병태생리학에 대한 통찰력과 MI 후 심부전에 대한 잠재적 치료법 개발에 대한 통찰력을 제공합니다.

고처리량 RNA 염기서열분석(RNA-Sequencing)은 차세대 염기서열분석(NGS)^7,8,9을 사용하여 전체 전사체를 매우 자세히 연구하는 데 사용되는 기술입니다. 최근 scRNA-Seq의 개발은 생물의학 연구 분야에 혁명을 일으켰습니다. 기존의 대량 염기서열 분석과 비교하여 scRNA-Seq는 단일 세포 수준 ^7,8에서 유전자 발현 프로필과 전사 이질성을 분석합니다. 이 기술은 MI 후 미세 환경에서 다양한 순환 세포 유형을 식별하고 심근 세포와 비심근 세포 간의 상호 작용을 밝혀냄으로써 MI ^9,10의 세포 병태생리학 연구를 크게 촉진합니다. 이러한 발견은 MI 후 심부전에 대한 새로운 치료 표적을 밝히는 데 더욱 기여합니다. 일반적으로, scRNA-seq-기반 MI 후 실험은 3개의 주요 섹션을 포함한다: (1) MI 후 동물 모델의 확립; (2) 세포 현탁액의 제조; (3) 샘플 시퀀싱 및 데이터 분석. 주목할 만한 것은, 세포 현탁액의 품질이 결과의 정확성을 결정하기 때문에 scRNA-Seq 실험의 준비에서 세포 현탁액을 준비하는 것이 가장 중요한 단계라는 것입니다.

이 프로토콜은 MI 후 심장 조직으로부터 비심근세포 세포 현탁액을 추출하도록 설계되었습니다. 중요한 것은 세포 생존율 및 분해능을 유지하기 위한 구체적인 세부 사항이 포함되어 있다는 것입니다. 한편, 생쥐용 수술 키트, 설치류 인공호흡기, 원심분리기 등 이 프로토콜에 사용되는 장비는 대부분의 동물 실험 센터 및 생물 의학 실험실에서 찾을 수 있으므로 이 프로토콜의 실험 비용은 상대적으로 저렴합니다. 또한, 경색의 시점과 부위를 변수로 고려하는 경우 이 프로토콜을 적용하여 광범위한 임상 시나리오, 특히 MI 후 합병증을 시뮬레이션할 수 있습니다.

Protocol

모든 실험은 절강 대학의 실험 동물 관리 및 사용 지침에 따라 수행되었으며 절강 대학의 동물 자문위원회의 승인을 받았습니다. 1. 좌전하행 관상동맥결찰술(LAD 결찰술) 수술 참고: 8주령의 수컷 C57BL/6J 마우스를 모델로 사용했습니다. MI 2주 후에 심장을 적출하였다. 좌전하행 관상동맥 결찰술은 앞서 기술하고 입증한 바와 같이 수행하였다<sup …

Representative Results

높은 활력을 갖는 단일 세포 현탁액은 이 프로토콜의 섹션 2를 구현하여 얻어졌습니다. 그러나 세포 단편은 여전히 관찰 될 수 있습니다 (그림 1A). 따라서, 품질16을 더욱 향상시키기 위해 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 수행하였다. FACS 후, 평균 세포 크기는 9.6 μm에서 9.1 μm로 감소하며 (표 1), 이는 FACS에 의해 세포 현탁액에서 세포 단편의 비율?…

Discussion

이 기사는 MI 후 마우스 심장에서 단일 비심근 세포를 분리하는 프로토콜을 설명하는 것을 목표로 했습니다. 이 프로토콜은 면역 세포, 내피 세포 및 섬유아세포를 포함하여 MI 후 미세 환경에서 다양한 유형의 세포를 고품질로 분리하는 데 적용할 수 있습니다. 세 가지 필수 요소는 단일 세포 시퀀싱을 위한 고품질 세포 현탁액을 얻는 데 중요합니다. 첫 번째는 효소 소화의 설정입니다. 세포 생존?…

Materials

Acridine Orange / Propidium Iodide Stain	Logos biosystems	F23001
Automated Cell Counter	Logos biosystems	L20001
Bovine Serum Albumin	Servicebio	G5001	Cytoprotective effect
Cell Counting Slides	Logos biosystems	L12001
Collagenase Type IV	Gibco	17104019	Digestive enzymes
Dispase II	Sigma	D4693	Digestive enzymes
Dnase I	Roche	11284932001	Prevent cell clumping
Falcon 40μm Cell Strainer	Falcon	352340	Remove cell clumps
Falcon 70μm Cell Strainer	Falcon	352350	Remove undigested tissue and clumps
Flow Cell Sorter	Beckman Coulter	B25982
Iodophor	OU QING SI	10054963976859
Needle Holder	FST	12061-01
Ophthalmic Forceps	RWD	F14012-10
Ophthalmic Scissors	RWD	S11036-08
Phosphate Buffered Saline	Servicebio	G4202-500ML
RBC Lysis Buffer	Beyotime	C3702-120ml	Remove red blood cells
Rib Retractor	FST	17005-04
Rodent Ventilator	Harvard	730043
RPMI 1640 Medium	Gibco	11875093	Solvent solution of enzyme
Sterile Scissor	RWD	S14014-10