생물학적 장벽의 침투 강화를 위한 순환 세포 침투 펩타이드의 구성
Summary
이 프로토콜은 방향족 가교를 갖는 고리형 세포 침투 펩타이드의 합성과 생물학적 장벽을 통한 투과성 평가를 설명합니다.
Abstract
암은 세계 보건에서 큰 도전이었습니다. 그러나 복잡한 종양 미세 환경은 일반적으로 더 깊은 종양 세포에 대한 치료제의 접근을 제한하여 종양 재발을 유발합니다. 생물학적 장벽의 제한된 침투를 극복하기 위해 세포 침투 펩타이드(CPP)가 우수한 막 전위 능력을 가지고 발견되었으며 다양한 화물을 세포로 전달하는 데 유용한 분자 수송체로 부상했습니다. 그러나 기존의 선형 CPP는 일반적으로 단백질 분해 안정성이 손상되어 생물학적 장벽을 가로지르는 투과성을 제한합니다. 따라서, 생물학적 장벽을 뚫을 수 있고 향상된 단백질 분해 안정성을 나타낼 수 있는 신규한 분자 수송체의 개발은 생물의학 응용에서 약물 전달 효율을 촉진하기 위해 매우 요구되고 있다. 우리는 이전에 방향족 가교결합을 가진 짧은 고리형 CPP 패널을 합성했으며, 이는 선형 CPP에 비해 암세포와 조직에서 우수한 투과성을 나타냈습니다. 여기에서는 형광 표지된 고리형 폴리아르기닌 R8 펩타이드 및 그 선형 대응물의 합성과 세포 투과성을 조사하기 위한 주요 단계에 대한 간결한 프로토콜이 설명되어 있습니다.
Introduction
지난 수십 년 동안 약물 전달을 위한 세포 침투 펩타이드(CPP) 개발이 급속히 발전했습니다. CPP는 신경 질환 1,2, 심장 질환3, 당뇨병4, 피부병5 및 암 6,7을 포함한 다양한 생명을 위협하는 질병의 치료를위한 분자 수송체로 널리 사용되었습니다. 암은 광범위한 연구 노력에도 불구하고 높은 이환율과 사망률을 동반하는 전 세계적인 건강 부담으로 남아 있습니다8. 암 치료의 심각한 장애물은 조밀한 세포외 기질(ECM), 비정상적인 종양 혈관 구조, 다막 장벽 및 높은 간질액 압력(IFP)과 같은 생리학적 장벽으로 인해 더 깊은 종양 세포에 대한 치료제의 제한된 접근입니다9. 따라서 생물학적 장벽을 넘어 화물을 운송할 수 있는 우수한 능력을 가진 새로운 CPP를 개발하는 것은 암 치료를 위한 필수 전략으로 간주됩니다10,11.
CPP는 물리화학적 특성12의 관점에서 양이온성, 양친매성 및 소수성 CPP로 분류할 수 있습니다. 이 중 양전하를 띤 HIV-TAT 펩타이드와 합성 폴리아르기닌은 생물의학 연구에서 상당히 중요하며 세포 내 약물 전달을 촉진하기 위해 광범위하게 연구되었습니다13. Tunnemann et al.은 R3 내지 R12 펩티드를 사용하여 수행된 세포 투과성 연구에 기초하여, 합성 폴리아르기닌 펩티드의 효율적인 세포 침투를 위해 8개의 아르기닌의 최소 길이가 필수적이라고 보고하였다14. 그러나, 이들 CPP는 일반적으로 생체 내에서 이들의 빠른 가수분해로 인해 짧은 혈장 반감기를 갖는다. 또한, 다중 세포막을 관통하는 것이 어렵기 때문에 이들의 트랜스-배리어 능력을 증가시키기 위한 CPP의 화학 구조의 최적화에 관해서는 알려진 바가 거의 없다(15). 따라서, 약물 전달 효율을 향상시키기 위해 생물학적 장벽을 관통할 수 있는 신규한 분자 수송체의 개발이 강력히 요구되고 있다. 2020년 Komin 등16 은 상피 단층을 가로지르는 나선 모티프(RLLRLLR)와 폴리아르기닌 꼬리(R7)를 포함하는 CL 펩타이드라는 CPP를 발견했습니다. CL 펩티드 변이체 세트는 또한 나선형 패턴을 변경하여 합성되었습니다. 이 탐사는 생물학적 장벽을 넘어 화물을 운송하기 위한 새로운 CPP 개발을 위한 중요한 지침이 될 수 있습니다. 또한, Dietrich et al. StAX 펩티드의 세포 투과성을 최적화하여 펩티드17의 전반적인 소수성을 증가시킴으로써 Wnt/β-카테닌 신호전달 경로를 억제하였다.
고리화에 의한 구조화되지 않은 선형 펩티드의 구조적 제한은 그들의 단백질 분해 안정성 및 투과성을 향상시키는 효과적인 방법이다18,19,20. 구조적 강화는 고리형 펩타이드의 프로테아제 저항성을 증가시켜 선형 펩타이드에 비해 생체 내에서 더 안정적으로 만듭니다. 또한, 펩티드의 고리화는 분자내 수소 결합을 촉진함으로써 잠재적으로 극성 펩티드 골격을 가릴 수 있고, 따라서 펩티드(21)의 막 투과성을 증가시킬 수 있다. 지난 20년 동안 화학선택적 고리화 방법은 모든 탄화수소, 락탐, 트리아졸, m-자일렌, 퍼플루오로아릴 및 기타 가교 결합과 같은 다양한 구조를 가진 고리형 펩타이드의 구성을 위한 효과적인 전략이 되었습니다22,23. 정교한 종양 미세 환경에 의해 부과된 생물학적 장벽은 고형 종양에서 약물의 침투를 감소시킬 수 있다24. 우리는 이전에 순환 CPP가 선형 CPP에 비해 효소 소화에 대해 우수한 저항성을 나타냈다는 것을 발견했다20. 또한, 펩타이드의 전반적인 소수성은 세포 투과성 향상에 매우 중요하다22. 위에서 논의한 연구를 기반으로 양전하를 띤 패턴, 증가된 전체 소수성 및 향상된 단백질 분해 안정성의 조합이 생물학적 장벽을 가로질러 CPP의 투과성을 증가시키는 가설을 세울 수 있습니다. 최근 연구에서, 우리는 위치 i와 i+7에서 방향족 가교결합을 갖는 두 개의 순환 CPP를 확인했는데, 이는 선형 CPP에 비해 종양 세포와 조직에서 향상된 투과성을 나타낸다15. 여기에서는 형광 표지된 순환 CPP의 합성을 위한 간결한 합성 프로토콜과 투과성을 조사하기 위한 주요 단계를 제시합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
구조적 제약을 통합함으로써 펩티드의 화학적 안정화는 펩티드26의 안정성 및 세포 투과성을 개선하기 위한 효과적인 전략인 것으로 입증되었다. 이 프로토콜에서는 방향족 가교를 갖는 고리형 CPP의 합성 및 생물학적 장벽에 걸친 투과성 평가를 위한 단계별 절차가 설명됩니다. 친수성 락탐 또는 트리아 졸 가교 결합22,27과 비교하여, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 중국 자연 과학 재단 (21708031), 중국 박사후 과학 재단 (BX20180264, 2018M643519) 및 중앙 대학 기초 연구 기금 (2682021ZTPY075)의 지원을 받고 있습니다.
Materials
| 1,2-ethanedithiol | Aladdin | K1722093 | stench |
| 2-(7-Azobenzotriazole)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HATU) | HEOWNS | A-0443697 | |
| 4,4'-bis(bromomethyl)biphenyl | TCI | B1921 | |
| 4T1 cells | ATCC | 4T1 cells were cultured in DMEM medium supplemented with 10% FBS (Hyclone) in a 37 °C humidified incubator containing 5% CO2. | |
| Acetonitrile | Adamas | 1484971 | toxicity |
| Dichloromethane | Energy | W330229 | skin harmful |
| Diethyl ether | Aldrich | 673811 | flammable |
| Dimethyl sulfoxide | Beyotime | ST038 | skin harmful |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | ||
| Electrospray Ionization Mass Spectrometer | Waters | G2-S Tof | |
| Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA) | BioFroxx | 1340 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | HyClone | ||
| Flow cytometer | Beckman Coulter | CytoFLEX | |
| Fluorescein isothiocyanate isomer (FITC) | Energy | E0801812500 | |
| Fluorescent microscope | Carl Zeiss | Axio Observer 7 | |
| Fmoc-Arg(Pbf)-OH | HEOWNS | F-81070 | |
| Fmoc-Cys(Trt)-OH | GL Biochem | GLS201115-35202 | |
| Fmoc-βAla-OH | Adamas | 51341C | |
| HeLa cells | ATCC | HeLa cells were cultured in DMEM supplemented with 10% FBS (Hyclone) in a 37 °C humidified incubator containing 5% CO2. | |
| High-Performance Liquid Chromatography | Agilent | Agilent 1260 | |
| High-Performance Liquid Chromatography column | Agilent | Poroshell EC-C18 120, 4.6 × 150 mm (pore size 120 Å, particle size 4 μm) | |
| Lyophilizer | SP Scientific | Vir Tis | |
| Methanol | Aldrich | 9758 | toxicity |
| Microtiter plate | Thermo μdrop plate | N12391 | |
| Morpholine | HEOWNS | M99040 | irritant |
| Multi-technology microplate reader | Thermo | VARIOSKAN LUX | |
| N,N-Diisopropylethylamine | HEOWNS | E-81416 | irritant |
| N,N-Dimethyl formamide | Energy | B020051 | harmful to skin |
| Poly-Prep column | Bio-Rad | 7321010 | polypropylene chromatography columns |
| Rink Amide MBHA resin (0.572 mmol/g) | GL Biochem | GLS180301-49101 | |
| Three-way stopcocks | Bio-Rad | 7328107 | |
| Tissue culture plate insert | LABSELECT | 14211 | |
| Trifluoroacetic acid | HEOWNS | T63278 | corrosive |
| Triisopropylsilane | HEOWNS | T-0284475 | |
| Trypsin | BioFroxx | 1004 | |
| Vacuum manifold | Promega | A7231 |
References
- Zhang, L., et al. Brain-targeted dual site-selective functionalized poly(β-amino esters) delivery platform for nerve regeneration. Nano Letters. 21 (7), 3007-3015 (2021).
- Park, T. E., et al. Enhanced BBB permeability of osmotically active poly(mannitol-co-PEI) modified with rabies virus glycoprotein via selective stimulation of caveolar endocytosis for RNAi therapeutics in Alzheimer’s disease. Biomaterials. 38, 61-71 (2015).
- Bian, J., et al. Effect of cell-based intercellular delivery of transcription factor GATA4 on ischemic cardiomyopathy. Circulation Research. 100 (11), 1626-1633 (2007).
- He, H., et al. The use of low molecular weight protamine chemical chimera to enhance monomeric insulin intestinal absorption. Biomaterials. 34 (31), 7733-7743 (2013).
- Kim, D., et al. A specific STAT3-binding peptide exerts antiproliferative effects and antitumor activity by inhibiting STAT3 phosphorylation and signaling. 암 연구학. 74 (8), 2144-2151 (2014).
- Yang, Y., et al. PEGylated liposomes with NGR ligand and heat-activable cell-penetrating peptide-doxorubicin conjugate for tumor-specific therapy. Biomaterials. 35 (14), 4368-4381 (2014).
- Wei, Y., et al. Intracellular paclitaxel delivery facilitated by a dual-functional CPP with a hydrophobic hairpin tail. ACS Applied Materials and Interfaces. 13 (4), 4853-4860 (2021).
- Vasan, N., Baselga, J., Hyman, D. M. A view on drug resistance in cancer. Nature. 575 (7782), 299-309 (2019).
- Cong, Y., et al. Microenvironment-induced in situ self-assembly of polymer-peptide conjugates that attack solid tumors deeply. Angewandte Chemie International Edition. 131 (14), 4680-4685 (2019).
- Blanco, E., Shen, H., Ferrari, M. Principles of nanoparticle design for overcoming biological barriers to drug delivery. Nature Biotechnology. 33 (9), 941-951 (2015).
- Tian, Y., Zhou, S. Advances in cell-penetrating peptides and their functionalization of polymeric nanoplatforms for drug delivery. Wiley Interdisciplinary Reviews. Nanomedicine and Nanobiotechnology. 13 (2), 1-12 (2021).
- Milletti, F. Cell-penetrating peptides: Classes, origin, and current landscape. Drug Discovery Today. 17 (15-16), 850-860 (2012).
- Turner, J. J., et al. Cell-penetrating peptide conjugates of peptide nucleic acids (PNA) as inhibitors of HIV-1 Tat-dependent trans-activation in cells. Nucleic Acids Research. 33 (21), 6837-6849 (2005).
- Tunnemann, G., et al. Live-cell analysis of cell penetration ability and toxicity of oligo-arginines. Journal of Peptide Science. 14 (4), 469-476 (2008).
- Shi, M., et al. Stapling of short cell-penetrating peptides for enhanced tumor cell-and-tissue dual-penetration. Chemical Communications. 58 (14), 2299-2302 (2022).
- Komin, A., et al. A peptide for transcellular cargo delivery: Structure-function relationship and mechanism of action. Journal of Controlled Release. 324, 633-643 (2020).
- Dietrich, L., et al. Cell permeable stapled peptide inhibitor of Wnt signaling that targets β-catenin protein-protein interactions. Cell Chemical Biology. 24 (8), 958-968 (2017).
- Tian, Y., et al. Stapling of unprotected helical peptides via photo-induced intramolecular thiol-yne hydrothiolation. Chemical Science. 7 (5), 3325-3330 (2016).
- De Araujo, A. D., et al. Comparative α-helicity of cyclic pentapeptides in water. Angewandte Chemie International Edition. 53 (27), 6965-6969 (2014).
- Chu, Q., et al. Towards understanding cell penetration by stapled peptides. Medicinal Chemistry Communications. 6 (1), 111-119 (2015).
- Bock, J. E., Gavenonis, J., Kritzer, J. A. Getting in shape: Controlling peptide bioactivity and bioavailability using conformational constraints. ACS Chemical Biology. 8 (3), 488-499 (2013).
- Tian, Y., et al. Effect of stapling architecture on physiochemical properties and cell permeability of stapled α-helical peptides: A comparative study. ChemBioChem. 18 (21), 2087-2093 (2017).
- White, C. J., Yudin, A. K. Contemporary strategies for peptide macrocyclization. Nature Chemistry. 3 (7), 509-524 (2011).
- Jain, R. K. Normalization of tumor vasculature: An emerging concept in antiangiogenic therapy. Science. 307 (5706), 58-62 (2005).
- Patgiri, A., Menzenski, M. Z., Mahon, A. B., Arora, P. S. Solid-phase synthesis of short α-helices stabilized by the hydrogen bond surrogate approach. Nature Protocols. 5 (11), 1857-1865 (2010).
- Baek, S., et al. Structure of the stapled p53 peptide bound to Mdm2. Journal of the American Chemical Society. 134 (1), 103-106 (2012).
- Traboulsi, H., et al. Macrocyclic cell penetrating peptides: A study of structure-penetration properties. Bioconjugate Chemistry. 26 (3), 405-411 (2015).
- Tian, Y., et al. A proline-derived transannular N-cap for nucleation of short α-helical peptides. Chemical Communications. 52 (59), 9275-9278 (2016).
- Muppidi, A., et al. Rational design of proteolytically stable, cell-permeable peptide-based selective Mcl-1 inhibitors. Journal of the American Chemical Society. 134 (36), 14734-14737 (2012).
- Wiradharma, N., et al. Synthetic cationic amphiphilic α-helical peptides as antimicrobial agents. Biomaterials. 32 (8), 2204-2212 (2011).
- Jones, A. T., Sayers, E. J. Cell entry of cell penetrating peptides: Tales of tails wagging dogs. Journal of Controlled Release. 161 (2), 582-591 (2012).
