वर्तमान प्रोटोकॉल प्लास्मोडियोफोरा ब्रासिका द्वारा प्रेरित पित्ताशय के हिस्टोलॉजिकल अवलोकन के लिए एक अनुकूलित विधि का वर्णन करता है। रोग की प्रगति के दौरान प्रतिलेखन कारकों और फाइटोहार्मोन की भागीदारी का अध्ययन करने के लिए फ्लोरेसेंस इमेजिंग से पहले हाइपोकोटाइल के विब्राटोम वर्गों को साफ किया जाता है। यह प्रोटोकॉल राल एम्बेडिंग सीमाओं को दूर करता है, जिससे फ्लोरोसेंट प्रोटीन के प्लांटा विज़ुअलाइज़ेशन में सक्षम होता है ।
मिट्टी से उत्पन्न प्रोटिस्ट प्लास्मोडियोफोरा ब्रासिका द्वारा ब्रासिका फसलों के संक्रमण से भूमिगत अंगों पर पित्त का निर्माण होता है। पित्ताशय के गठन के लिए सेलुलर रीप्रोग्रामिंग और संक्रमित पौधे के चयापचय में परिवर्तन की आवश्यकता होती है। यह एक रोगज़नक़-उन्मुख शारीरिक सिंक स्थापित करने के लिए आवश्यक है जिसकी ओर मेजबान पोषक तत्वों को पुनर्निर्देशित किया जाता है। इस विशेष पौधे-रोगज़नक़ बातचीत और तंत्र की पूरी समझ के लिए जिसके द्वारा मेजबान विकास और विकास को विकृत और पुन: पैटर्न किया जाता है, सेलुलर रिज़ॉल्यूशन के साथ पित्त गठन के साथ आंतरिक परिवर्तनों को ट्रैक और निरीक्षण करना आवश्यक है। फ्लोरोसेंट दाग और फ्लोरोसेंट प्रोटीन के संयोजन के तरीकों को अक्सर पौधों में शारीरिक और शारीरिक प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए नियोजित किया जाता है। दुर्भाग्य से, पित्ताशय का बड़ा आकार और उनकी कम पारदर्शिता माइक्रोस्कोप के तहत पूरे माउंट अवलोकन करने में प्रमुख बाधाओं के रूप में कार्य करती है। इसके अलावा, कम पारदर्शिता क्लबरूट रोग की प्रगति और पित्त गठन का अध्ययन करने के लिए प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के रोजगार को सीमित करती है। यह लेख पी ब्रासिके-संक्रमित पित्ताशय का निरीक्षण करने के लिए एपिफ्लोरेसेंस और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी की सुविधा के लिए पित्ताशय को ठीक करने और साफ़ करने के लिए एक अनुकूलित विधि प्रस्तुत करता है। तेजी से ऑप्टिकल क्लियरिंग के लिए एक ऊतक-समाशोधन प्रोटोकॉल का उपयोग किया गया था, जिसके बाद संरचनात्मक परिवर्तनों का पता लगाने और फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ टैग किए गए प्रमोटर संलयन और रिपोर्टर लाइनों के साथ जीन अभिव्यक्ति का स्थानीयकरण करने के लिए विब्राटोम सेक्शनिंग का उपयोग किया गया था। यह विधि पौधों में अन्य रोगज़नक़-ट्रिगर संरचनाओं में सेलुलर और शारीरिक प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए उपयोगी साबित होगी, जैसे कि नेमाटोड-प्रेरित सिंकिटिया और रूट गांठ, साथ ही कीड़े के कारण पत्ती के पित्त और विकृतियां।
रोगजनकों या कीड़ों से प्रभावित पौधे असामान्य संरचनाओं (अंग विरूपण या पित्ताशय) को विकसित कर सकते हैं, जो आक्रमणकारी को पोषक तत्वों को निगलनेऔर प्रजनन करने की अनुमति देते हैं। यहां, प्रोटिस्ट प्लास्मोडियोफोरा ब्रासिका से संक्रमित पौधों के भूमिगत भागों पर विकसित होने वाले पित्ताशय में होने वाले परिवर्तनों का अध्ययन करने के लिए एक कुशल हिस्टोपैथोलॉजिकल दृष्टिकोण किया गया था (चित्रा 1)। इस रोगज़नक़ से जुड़ा मामूली धागा इस तथ्य से उभरता है कि पी ब्रासिके आराम करने वाले बीजाणु कई वर्षों तक पौधों पर आक्रमण करने की अपनी क्षमता को बनाए रख सकते हैं। तिलहन रेप (ब्रासिका नेपस) की बड़े पैमाने पर खेती के मामले में, यह एक गंभीर समस्या है क्योंकि आर्थिक कारक फसल रोटेशन को प्रतिबंधित करते हैं, जिससे मिट्टी में बीजाणु संचय होताहै। पी ब्रासिका के कारण क्लबरूट रोग के लिए तिलहन बलात्कार का प्रतिरोध आनुवंशिक रूप से निर्धारित होता है। अफसोस की बात है, रोगज़नक़ अक्सर अपने जीव विज्ञान और संकीर्ण आनुवंशिक पूल के कारण प्रतिरोध को मात देता है जिससे तिलहन बलात्कार उत्पन्न हुआ था। इसलिए, मेजबान पौधों में संक्रमण के बाद की प्रतिक्रियाओं और रोग की प्रगति को धीमा करने या कुछ लक्षणों को विकसित होने से रोकने की उनकी क्षमता का अध्ययन करना प्रासंगिक हो गया है।
क्लबरूट रोग में, गंभीरता का मूल्यांकन आम तौर पर पित्ताशय के विकास और जड़ प्रणाली क्षति की डिग्री के आधार पर किया जाता है। इसे रोग सूचकांक-डीआई के रूप में जाना जाता है3. हालांकि, यह इस पौधे-रोगज़नक़ बातचीत के सही मूल्यांकन को पूरी तरह से कैप्चर नहीं करता है। विशेष रूप से, यह संबोधित नहीं करता है कि रोगज़नक़ जड़ों के भीतर कैसे वितरित किया जाता है और यदि पौधे रोक सकता है P. brassicae इसके ऊतकों के भीतर आंदोलन। इसके अलावा, यह अनुमान लगाना आसान नहीं है कि किस हद तक P. brassicae भूमिगत अंग शरीर रचना विज्ञान को पुन: प्रोग्राम करता है। मॉडल संयंत्र पर अध्ययन Arabidopsis thaliana दिखाया है कि P. brassicae संक्रमण से जाइलोजेनेसिस (दीक्षा और परिपक्वता चरण दोनों) के निषेध और पित्ताशय के भीतर फ्लोएम भेदभाव में वृद्धि होती है4,5. इसके अलावा, संक्रमित पौधों की जड़ों और हाइपोकोटिल में, कैम्बियल सेल संतान माइटोटिक अवस्था को नहीं छोड़ती है और स्वस्थ पौधों की तुलना में लंबे समय तक फैलती है6. यह प्रक्रिया पित्ताशय के अंतिम आकार को नियंत्रित करती है और संक्रमित पौधे के भीतर उत्पादित रोगज़नक़ आराम करने वाले बीजाणुओं की संख्या निर्धारित करती है। P. brassicaeमेजबान में संचालित विकास, चयापचय और शारीरिक रीप्रोग्रामिंग बहुत जटिल है7; इसलिए, पित्ताशय के भीतर आंतरिक परिवर्तनों के निरीक्षण की अनुमति देने वाले उपकरणों का अनुप्रयोग इस बातचीत का ठीक से आकलन करने के लिए महत्वपूर्ण है। जीवन चक्र की प्रगति P. brassicae मेजबान सेल चयापचय के रीप्रोग्रामिंग के साथ है, जिसे स्टार्च या लिपिड जमाव के रूप में देखा जा सकता है7,8. पित्ताशय की सफल माइक्रोस्कोपी के लिए मुख्य बाधा उनकी कम पारदर्शिता से आती है। इसके कारण, पित्ताशय के भीतर क्लबरूट-संचालित परिवर्तन प्रस्तुत करने वाले अधिकांश हिस्टोलॉजिकल नमूने निर्धारण-एम्बेडिंग (मोम या राल) तकनीकों से उत्पन्न होते हैं, जिसके बाद माइक्रोटोम सेक्शनिंग होती है। इस तरह के दृष्टिकोणों का सफलतापूर्वक क्लबरूट पित्त में सक्रिय कई जीनों के लिए प्रमोटर गतिविधि का पता लगाने के लिए उपयोग किया गया था4,5 या विभिन्न धुंधला तकनीकें किसके अवलोकन की सुविधा प्रदान करती हैं? P. brassicae जीवन-चक्र की प्रगति9. हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि फिक्सिंग और एम्बेडिंग चरण समय लेने वाले होते हैं और इसके परिणामस्वरूप महत्वपूर्ण बायोमोलेक्यूल्स (जैसे, लिपिड) आंशिक या पूर्ण रूप से धुल जाते हैं, जो कुछ अवलोकनों में काफी बाधा डालते हैं। हाल ही में P. brassicae मेजबान में जीवन चक्र की प्रगति को फ्लोरोसेंट इन सीटू हाइब्रिडाइजेशन (फिश) की मदद से देखा गया था, जिसमें एक सबाथ-प्रकार मेथिलट्रांसफेरेज़ (PbBSMT) जीन-विशिष्ट जांच का उपयोग बीजाणु गठन को चिह्नित करने के लिए किया गया था10. एक अच्छा विकल्प अन्य प्रतिदीप्ति-आधारित तरीकों का उपयोग है जहां कुछ सेलुलर घटकों की ऑटोफ्लोरेसेंस, फ्लोरोसेंट प्रोटीन मार्करों से जुड़े जीन के 5′- अपस्ट्रीम नियामक क्षेत्रों की गतिविधि, और विशेष फ्लोरोसेंटली टैग किए गए प्रोटीन का संचय देखा जा सकता है। हालांकि, नमूनों की कम पारदर्शिता के अलावा, ऐसी वस्तुओं से जुड़ी एक बड़ी खामी अनिर्धारित नमूनों के साथ काम करना है, जो उस समय को काफी कम कर देता है जिसमें अच्छी गुणवत्ता वाली छवियों को प्रलेखित किया जा सकता है। 2015 में, कुरिहारा एट अल।11 एक समाशोधन अभिकर्मक विकसित किया, जो फ्लोरोसेंट प्रोटीन के संरक्षण की अनुमति देता है और पौधे के ऊतक नमूनों की पारदर्शिता को बढ़ाता है। इसके अतिरिक्त, यह कई हिस्टोलॉजिकल दाग के साथ संगत है। हाल ही में, पौधे के ऊतकों में विभिन्न सेल दीवार घटकों की कल्पना करने के लिए एक ही तकनीक को सफलतापूर्वक लागू किया गया था12,13. यहां, इस प्रोटोकॉल का उपयोग विभिन्न क्लबरूट पित्त विकास पहलुओं का विश्लेषण करने के लिए किया गया है। वर्कफ़्लो पित्ताशय, विब्राटोम सेक्शनिंग, ऊतक समाशोधन, धुंधलापन और प्रतिदीप्ति इमेजिंग के निर्धारण के साथ शुरू होता है। किसी की जरूरतों के आधार पर, सीधे या विशेष धुंधला होने के बाद, परिणामी वर्गों को एपिफ्लोरेसेंस या कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के तहत निरीक्षण के अधीन किया जा सकता है। यह विधि जीन अभिव्यक्ति और शारीरिक प्रतिक्रियाओं में स्थानीय परिवर्तनों का अध्ययन करने के लिए एक प्रभावी समाधान प्रदान करती है, जिसमें फाइटोहार्मोन संतुलन और सिग्नलिंग शामिल है। आराम करने वाले बीजाणुओं और परिपक्वता गतिशीलता के वितरण पैटर्न को देखकर रोग की प्रगति को ट्रैक किया जा सकता है। इसके अलावा, प्रोटोकॉल को आसानी से इमेजिंग विशेषता परिवर्तनों के लिए लागू किया जा सकता है P. brassicae संक्रमित पौधे, जिसमें जाइलोजेनेसिस का निषेध या मेजबान पौधे रक्षा प्रतिक्रियाएं प्रतिरोधी जीनोटाइप में स्थानीय लिग्निफिकेशन के रूप में दिखाई देती हैं। इस प्रोटोकॉल में उदाहरण साइट पर आयोजित इमेजिंग से आते हैं Arabidopsis thaliana नमूना; हालांकि, प्रोटोकॉल को अन्य फसल प्रजातियों से संबंधित अन्य फसल प्रजातियों पर भी लागू किया जा सकता है Brassicaceae परिवार। नीचे वर्णित विधि सेलुलर संरचनाओं और पित्त गठन के साथ आणविक परिवर्तनों के भविष्य के विस्तृत अध्ययन की सुविधा प्रदान करेगी P. brassicaeसंक्रमित पौधे।
प्रोटोकॉल का सामान्य वर्कफ़्लो काफी सीधा है, और पित्त विकास के सभी चरणों को आसानी से चित्रित और विशेषता दी जा सकती है (चित्रा 2)। चूंकि पी ब्रासिका एक मिट्टी जनित रोगज़नक़ है, इसलिए सभी प्रयोगों को मिट्टी आधारित प्रणालियों में किया जाना चाहिए। रोगज़नक़ अम्लीय स्थितियों को पसंद करता है; इसलिए, गैर-चूने-उपचारित मिट्टी सब्सट्रेट्स का उपयोग किया जाना चाहिए। हालांकि पी ब्रासिका मनुष्यों के लिए खतरा पैदा नहीं करता है, यह सख्ती से एक पौधे रोगज़नक़ है जो मिट्टी और पानी के माध्यम से फैल सकता है। इसलिए, संक्रमित पौधे के सभी हिस्सों, साथ ही मिट्टी को प्रयोग के बाद ऑटोक्लेविंग या ब्लीच के साथ उपचार द्वारा नष्ट करने की आवश्यकता होती है।
पित्ताशय के विब्राटोम-कट वर्गों पर समाशोधन समाधान लागू करना निश्चित रूप से पी ब्रासिका और मेजबान पौधे के बीच बायोट्रोफिक इंटरैक्शन का अध्ययन करने की क्षमता को बढ़ाता है। यद्यपि क्लियरिंग प्रोटोकॉल हाथ के वर्गों पर भी लागू होता है, यह विब्राटोम अनुभागों के साथ बेहतर काम करता है। पीएफए फिक्सेटिव में नमूने ठीक करना प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम के रूप में कार्य करता है क्योंकि नमूने तब सेक्शनिंग के साथ आगे बढ़ने से पहले कुछ दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किए जा सकते हैं। यह निर्धारण के दौरान फ्लोरोसेंट प्रोटीन की अभिव्यक्ति और संरक्षण से समझौता किए बिना सीमित अवधि के लिए नमूने स्टोर करने के लिए लचीलापन प्रदान करता है।
नील रेड (डीएमएसओ या मेथनॉल में) अपनी हाइड्रोफोबिसिटी के कारण राल वर्गों के साथ असंगत है, जो राल को भंग कर देता है और राल-एम्बेडेड अनुभाग17 को नष्ट कर देता है। इस प्रकार, वाइब्रेटोम अनुभाग विकासशील पित्ताशय के भीतर रोगज़नक़ वितरण और इसके जीवन-चक्र का अध्ययन करने के लिए सहायक साबित होते हैं, जिसमें नील लाल धुंधलापन आसानी से उपयोग किया जा सकता है।
इस प्रोटोकॉल में उपयोग किया जाने वाला समाशोधन समाधानअत्यधिक बहुमुखी है, जिससे सेल की दीवारों के विभिन्न बायोमोलेक्यूल्स / घटकों (सुबेरिन, लिग्निन, सेल्यूलोज और फंगल इंटरैक्शन में चिटिन) को दागने के लिए विभिन्न संयोजनों में विभिन्न प्रकार के फ्लोरेसेंस दाग का उपयोग किया जा सकता है। फ्लोरोसेंट जीएफपी मार्कर लाइनों के काउंटरस्टेन वर्गों को भी संभव है और इस प्रकार विशेष कोशिकाओं या पित्ताशय के क्षेत्रों में रोगज़नक़ की उपस्थिति के साथ प्रमोटर गतिविधि या प्रोटीन संचय पैटर्न को सहसंबंधित करना संभव है। हालांकि, जाइलम और रोगज़नक़ से भरे विशाल कोशिकाओं से पृष्ठभूमि ऑटोफ्लोरेसेंस को समाशोधन प्रोटोकॉल के बाद भी समाप्त नहीं किया जा सका। यह पित्ताशय के गठन के बाद के चरणों के दौरान फ्लोरोसेंट मार्करों को देखने के लिए एक सीमा प्रस्तुत करता है, खासकर जब एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग करते हैं और कमजोर संकेतों की इमेजिंग करते हैं।
फ्लोरोसेंट संकेतों की अभिव्यक्ति / संचय के निम्न स्तर के कारण, प्रतिलेखन कारकों का पता लगाना मुश्किल है, लेकिन, इस तकनीक के साथ, उनके लिए संतोषजनक चित्र प्राप्त करना संभव है। कुल मिलाकर, ऊतक-समाशोधन दृष्टिकोण के साथ विब्राटोम सेक्शनिंग का संयोजन जटिल पित्त ऊतकों के हिस्टोलॉजिकल अवलोकनों के लिए टूलकिट का विस्तार करता है। इस प्रोटोकॉल का लचीलापन ऊतक निर्धारण की प्रक्रिया को आसान बनाता है और फ्लोरोसेंट प्रोटीन और प्रमोटर गतिविधियों का निरीक्षण करने के लिए ताजा ऊतक नमूनों को काटने और इमेजिंग करने के लिए आवश्यक समय को कम करता है। आगे के सुधारों के साथ और विभिन्न बायोमोलेक्यूल्स के लिए विशिष्ट अन्य फ्लोरोसेंट रंगों का उपयोग करके, यह विधि हिस्टोलॉजिकल अध्ययन और जटिल ऊतक संगठन के साथ घने, अपारदर्शी ऊतकों के छवि विश्लेषण में अधिक प्रगति को चिह्नित करेगी। हाल के दिनों में, प्रस्तुत ऊतक समाशोधन विधि विभिन्न फ्लोरोसेंट संकेतों11,12,13 के एक साथ अधिग्रहण को संयोजित और सक्षम करने के लिए एक लोकप्रिय और व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले प्रोटोकॉल के रूप में उभरी है। ऐसी तकनीकों में भविष्य के विकास और संशोधन सेलुलर स्तर पर पौधे-रोगज़नक़ इंटरैक्शन को देखने के लिए छवि संकल्प में काफी सुधार करेंगे।
The authors have nothing to disclose.
इस काम को नेशनल साइंस सेंटर पोलैंड ओपस 17 अनुदान संख्या 2019/33/बी/एनजेड9/00751 ” प्लास्मोडियोफोरा ब्रासिका द्वारा संक्रमित पौधों में लंबी दूरी के संवहनी समन्वय” द्वारा समर्थित किया गया था। हम प्रोएचसीए 2: : ईआरआरएफपी लाइन साझा करने के लिए प्रोफेसर यर्जो हेलारिट्टा (सैन्सबरी प्रयोगशाला, कैम्ब्रिज विश्वविद्यालय) को धन्यवाद देते हैं।
2N Sulfuric acid (H2SO4) | Roth | UN2796 | pH adjustment |
Agarose | PRONA | BGQT100 | Embedding |
Basic Fuchsin | BIOSHOP | BSF410.5 | Fluorescent dye |
Calcofluor White | Sigma Aldrich | 18909-100ML-F | Fluorescent dye |
Commercial Bleach | Domestos | ||
Cyanoacrylate/ Instant glue | Kropelka | Adhesive | |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | BIOSHOP | DMS555.500 | Solvent |
Epifluorescence microscope | Carl Zeiss M2 automated epifluorescence microscope with Colibri LED system | Carl Zeiss M2 | Carl Zeiss Filter Set filter set 38, 43, 49 used |
Fully automated Vibratome | Leica | VT1200 S | |
Lightmeter /Photometer | LI-COR Biosciences | LI-250A + LI-190R quantum sensor | For measuring light intensity within the 400-700nm (PAR) waveband |
Masking tape | For sticking agarose block on mould | ||
Murashige & Skoog Medium (MS Medium) | Duchefa Biochemie | MO222.0050 | Plant Growth Medium |
Nile Red | Sigma Aldrich | N3013-100MG | Fluorescent dye |
Paraformaldehyde PFA | Sigma Aldrich | 158127-100G | Fixative |
Potassium Chloride (KCl) | POCH | 739740114 | PBS component |
Potassium Hydroxide (KOH) | Sigma Aldrich | P1767-250G | pH adjustment |
Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | BIOSHOP | PPM302.500 | PBS component |
Sodium chloride (NaCl) | BIOSHOP | SOD001.1 | PBS component |
Sodium Deoxycholate | Sigma Aldrich | D6750-25G | Clearing Solution |
Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4 · 2H2O) | POCH | 799490116 | PBS component |
Triton X-100 | BIOSHOP | TRX506.100 | Fixative |
Urea | Sigma Aldrich | U5378-100G | Clearing Solution |
Vacuum/Pressure pump and Dessicator | Welch by Gardner Denver | 2522C-02 | For Vacuum Infilteration |
Xylitol | Sigma Aldrich | X3375-25G | Clearing Solution (componenet) |