이 방법은 콜로니 형성 단위(CFU)를 플레이트하기 위해 96웰 플레이트 형식을 사용하여 미생물 풍부도를 정량화하고 전체 파리 균질물 샘플의 초파리 마이크로바이옴에 적용됩니다. CFU는 여기에 제공된 자동 이미지 분석 소프트웨어로 계산됩니다.
동물의 내장은 숙주 발달, 건강 및 행동에 영향을 미치는 공생 미생물에 의해 식민지화됩니다. 집락화의 정확한 정량화는 미생물 구성을 검증하고 그 효과를 연구하기 위해 숙주와 미생물 간의 복잡한 상호 작용을 연구하는 데 필수적입니다. 초파리 멜라노가스터는 토착 미생물 다양성이 낮고 정의된 미생물 구성으로 사육하기에 경제적이며 장내 미생물군집을 연구하기 위한 모델 유기체로 부상했습니다. 개별 유기체의 미생물군집을 분석하려면 어떤 미생물 종이 존재하는지 식별하고 절대 풍부도를 정량화해야 합니다. 이 기사는 많은 수의 개별 파리 미생물 군집을 분석하는 방법을 제시합니다. 파리는 96웰 플레이트에서 준비되므로 한 번에 많은 수의 샘플을 처리할 수 있습니다. 미생물 풍부도는 일련의 반점에서 단일 한천 플레이트에 최대 96 개의 전체 파리 균질 물을 도금 한 다음 각 지점에서 자라는 집락 형성 단위 (CFU)를 계산하여 정량화됩니다. 이 도금 시스템은 ImageJ 플러그인을 사용하여 플레이트 사진, 형광 콜로니 분화 및 콜로니 자동 계수를 통합하는 자동화된 CFU 정량화 플랫폼과 쌍을 이룹니다. 장점은 (i) 이 방법이 처리 간의 차이를 감지할 만큼 충분히 민감하고, (ii) 스폿 도금 방법이 기존 도금 방법만큼 정확하며, (iii) 자동 계수 공정이 수동 계수보다 정확하고 빠르다는 것입니다. 여기에 제시된 워크플로우는 많은 수의 반복에서 CFU의 고처리량 정량화를 가능하게 하며 체외 및 기타 소형 동물 모델을 포함한 다른 미생물학 연구 시스템에 적용할 수 있습니다.
장내 미생물총과 동물 숙주 사이의 관계는생물학적 연구1의 최전선에 점점 더 많이 등장하고 있으며, 이는 미생물군집의 균주 구성이 숙주 생리학 2,3,4에 중요하다는 것을 보여줍니다. 발견의 속도는 높은 자연적 개인 간 변이 및 식민지 박테리아 5,6,7의 높은 다양성과 같은 교란 요인에 의해 제한되었습니다. 초파리인 초파리 멜라노가스터(Drosophila melanogaster)는 자연적으로 낮은 다양성의 미생물군집, 취급 용이성 및 강력한 숙주 유전학 8,9,10,11로 인해 유망한 모델로 부상했습니다. 파리는 무균으로 만들 수 있고 정의된 미생물총(12)과 재연관될 수 있으며, 식물상이 파리의 생리학적 형질(13,14)에 영향을 미치는 것으로 나타났다. 타고난 식물상은 모두 배양 가능한 제한된 박테리아 세트로 구성되며, 이들의 가까운 친척도 락토바실러스, 프로테오박테리아 및 엔테로코커스15를 포함한 포유류의 장에 내인성입니다.
숙주 특성에 대한 마이크로바이옴의 영향을 연구하려면 존재하는 종과 절대 풍부도 측면에서 마이크로바이옴을 정량화해야 합니다16. 파리 마이크로바이옴을 분석하는 주된 방법은 콜로니 형성 단위(CFU) 카운트17, 16S rRNA 유전자 앰플리콘 시퀀싱9 및 16S rRNA 유전자18의 qPCR입니다. CFU 계수는 값비싼 시약 없이 얻을 수 있고, 이들은 박테리아 세포(19)의 생존성을 확인한다. qPCR을 포함하는 16S 기술은 미생물의 분류학적 정체성이 그들의 성장 요건 또는 콜로니 형태학에 관계없이 확인될 수 있다는 점에서 이점이 있다(20).
실험에서 알려진 박테리아(gnotobiotic flies)의 정의된 마이크로바이옴이 있는 파리를 사용하는 경우 CFU 카운트는 시퀀싱21에 비해 특별한 이점이 있습니다. 시퀀싱은 비용이 많이 들고 DNA 추출, PCR 기반 라이브러리 준비 및 상대적 풍부도를 얻기 위해 고처리량 시퀀싱이 필요합니다22. 높은 비용으로 인해, 고처리량 시퀀싱 방법은 일반적으로 샘플당 가격을 낮추기 위해 대량으로 수행될 필요가 있다(23). 절대 풍부도16을 얻기 위해서는 qPCR과 같은 추가 방법이 필요합니다. 대조적으로, CFU 카운트는 빠르고 저렴하며 생존 가능한 세포의 절대 수를 제공합니다. 초파리8 및 기타 작은 마이크로바이옴 모델 24, 웜, Caenorhabditis elegans 25,26 및 뇨토비오로 성장한 유충 제브라피쉬, 다니오 레리오(Danio rerio)27을 포함하여, 제한된 범위의 박테리아를 가지며, 이는 알려진 성장 특성28을 갖는다. 이러한 경우, 특히 gnotobiotic 동물의 경우, CFU 계수는 다종 장내 공동체 21,27,29 내의 모든 박테리아 종을 구별 할 수 있습니다. 더 높은 처리량의 CFU 계수 방법은 마이크로바이옴의 구성을 측정하는 비용 효율성과 속도를 더욱 향상시키고 다른 많은 미생물학 실험에 적용할 수 있습니다.
한천 기반 성장 배지에서 박테리아 현탁액의 연속 희석 도금으로 CFU를 계수하는 것은 미생물학 분야의 표준 방법입니다. 그런 다음 판에서 자라는 식민지를 수동으로 계산합니다. 희석을 통해 연구원은 셀 수 있는 콜로니 밀도(예: 플레이트당 ~100CFU)를 선택할 수 있으며, 이는 콜로니가 서로 성장하지 않고 합리적인 시간 내에 계산될 수 있음을 의미합니다. 대부분의 미생물학자들은 140년 전 Robert Koch의 실험실에서 개발된 것과 본질적으로 동일한 CFU 계수 방법을 사용하며 많은 응용 분야에서 이 방법이 여전히 적합합니다. 그러나 많은 수의 샘플을 정량화하려고 할 때 문제가 발생합니다. 단일 샘플은 가산 가능한 CFU를 얻기 위해 샘플의 1-10 연속 희석을 도금해야 할 수 있으므로 수십 개 이상의 샘플을 포함하는 실험은 부담이됩니다. CFU 열거의 효율성을 높이기 위해 다양한 방법이 개발되었습니다. 자동 나선형 도금은 연속 희석(30)의 필요성을 제거하여 CFU 계수에 하나의 플레이트만 필요하지만 샘플을 도금하는 시간을 늘립니다. 단일 플레이트 직렬 희석 스포팅 (SP-SDS)은 샘플 당 더 적은 플레이트에서 CFU 추정을 허용합니다31. 이러한 방법은 기존의 확산 도금 방법을 개선한 것이지만 여전히 박테리아 시료를 단독으로 취급 및 도금해야 하므로 높은 처리량에는 적합하지 않습니다. 96웰 플레이트에서 샘플을 처리하고 직사각형 한천 플레이트에서 96개의 샘플을 스폿 플레이팅하면 샘플(19)의 처리량이 크게 향상됩니다.
마이크로바이옴은 일반적으로 여러 균주와 종으로 구성됩니다. 종은 종종 콜로니 형태 또는 성장 배지에 의해 구별될 수 있지만, 형광은 상이한 유형의 박테리아 및 이들의 성장 형질을 추가로 구별하기 위해 사용될 수 있다(32). 예를 들어, 동일한 종의 다른 유전자형은 서로 다른 유전적으로 암호화된 형광 단백질로 표지될 수 있습니다. 형광을 포함하는 플레이트 이미징 방법을 통해 연구자들은 CFU 기반 분석에서 이러한 유전 기술을 활용할 수 있습니다32. 형광을 고처리량 CFU 계수 방법에 통합하면 유용성이 더욱 향상됩니다.
CFU를 수동으로 계수하는 것은 샘플 수가 많은 경우 번거로워집니다. CFU의 자동 계수는 플레이트를 촬영하고 특수 소프트웨어(33)를 사용하여 이미지를 처리함으로써 수행될 수 있다. Sieuwerts 등은 종래의 디지털 사진 및 ImageJ 소프트웨어19를 사용하여 자동 콜로니 계수와 스폿 도금의 향상된 도금 효율을 결합했다.
특정 미생물 및 숙주 협회의 표현형을 스크리닝하는 고처리량 방법은 마이크로바이옴 커뮤니티 어셈블리와 숙주 건강 및 피트니스에 미치는 영향에 대한 연구에 도움이 될 것입니다. 초파리 마이크로바이옴 연구를 위해 고처리량 미생물학 플랫폼은 96웰 플레이트 형식의 파리 샘플 처리, 박테리아 용해 없는 파리 용해, 스팟 플레이팅의 효율성, 형광을 사용하고 다중 형광단을 구별하는 기능, CFU 플레이트의 재현 가능한 이미징을 위한 제어된 조명 환경 및 신뢰할 수 있는 자동 콜로니 계수 소프트웨어를 통합합니다. 이 기사에서는 간단하고 빠르며 자동화된 gnotobiotic 파리의 CFU 분석에 최적화된 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 이전에 발표된 최고의 방법을 결합하고 초파리의 장내 마이크로바이옴을 탐색하는 데 최적화된 새로운 워크플로를 설명합니다.
여기에 제시된 세부 기술을 통해 CFU 계수 실험에서 평가할 수 있는 샘플 수를 >100배 늘릴 수 있습니다. 이 기술은 개별 파리를 분석하기 위해 96웰 플레이트 형식을 사용하여 Drosophila 12,35,36의 마이크로바이옴 실험을 위한 기존 방법을 발전시킵니다. 또한 보다 효율적인 스폿 도금 방법(19,31)과 사진 및 콜로니 계수 플랫폼을 통한 자동화된 워크플로우를 적용합니다. 초파리에 대한 이 방법의 중요성은 실험을 96웰 플레이트 형식으로 표준화하여 자동화를 통해 많은 수의 생물학적 복제물을 동시에 처리하여 CFU의 고처리량 정량화를 달성할 수 있도록 하는 것입니다.
96웰 플랫폼은 전달 빈도가 증가하고 일시적인 박테리아의 “제거”가 평균 존재비와 샘플 간의 변동을 크게 감소시킨다는 것을 보여주며(그림 1B,C), 이 개선된 프로토콜의 엄격성을 보여줍니다. 공동 주택 파리의 한 가지 한계는 파리 사이의 박테리아의 수평 이동입니다. 제안된 해결책은 Whole Animal Feeding Flat38과 같은 96웰 플레이트 형식으로 파리를 개별적으로 유지하는 것입니다.
파리를 에탄올로 씻었을 때 박테리아 부하의 현저한 감소는 관찰되지 않았지만,이 파리는 3 일 동안 외부 박테리아가있는 곳에서만 보관되었습니다. 더 긴 기간 동안 수용하면 더 큰 박테리아 부하가 축적 될 수 있습니다39. 따라서 에탄올로 세척하는 것이 좋습니다.
파리를 96웰 플레이트로 옮기는 것은 워크플로를 설정하기 위한 중요한 첫 번째 단계입니다(그림 1A). 파리가 씻겨지면 한 번에 하나씩 우물에 분배됩니다. 플레이트 차트는 이 단계에서 각 웰에 어떤 조건이 있는지 확인하고 “파리가 손실되었습니다”와 같은 메모를 추가하는 데 유용합니다. 균질화는 몇 가지 중요한 주의 사항이 있는 또 다른 중요한 단계입니다. 박테리아는 파리가있을 때 균질화 과정에서 살아남 았으며 (그림 1D, E), 아마도이 원리는 박테리아가 파리의 내장 내부에있을 때도 마찬가지입니다. 그러나 박테리아는 비드 비터 플레이트에서만 균질화될 때도 사멸되며, 이는 균질화가 특정 상황에서 박테리아 세포를 죽일 수 있음을 보여주며, 예를 들어 해부된 내장을 균질화하는 경우 중요할 수 있는 한계입니다. 특히, 균질화할 때 CFU의 손실은 샘플의 CFU 수에 따라 달라지며, 웰당 ~105 CFU를 사용할 때 손실이 최소화됩니다. CFU의 추가 보존은 중간에 균질화를 중지하고 플레이트를 얼음 위에서 냉각함으로써 달성할 수 있습니다.
균질화는 알려진 수의 CFU가 무균 파리와 혼합 된 대조 실험을 기반으로이 프로토콜에서 5 분 동안 수행되었으며, 이는 파리 박테리아에 대해 경험적으로 작동했습니다. 박동이 적으면 더 큰 플라이 부품이 존재하여 피펫팅을 방해하는 반면, ~10분의 훨씬 더 긴 균질화 시간으로 인해 CFU 카운트가 더 가변적입니다. 원뿔형 플레이트 웰의 더 작은 부피와 각진 모양은 원통형 2mL 튜브에 비해 비드 박동의 효율성을 감소시키는 것으로 관찰되었습니다. 이 일반적인 접근법에 대한 많은 변형이 가능하며, 여기에는 어떤 박테리아 균주, 어떤 비드 박동 용기, 어떤 비드 및 어떤 파리 유전자형이 사용되는지가 포함됩니다. 개별 사용자 사례는 포지티브 컨트롤을 사용하여 접근 방식을 설정해야 합니다.
스팟 도금 방법은 특정 방식으로 사용되었다 : PBS 중 L. plantarum WF의 1 : 2 희석물을 MRS 플레이트 상에 발견하고, 2 일 동안 30 °C에서 배양 하였다 (더 짧은 배양 시간은 더 작은 콜로니 크기를 생성하기 위해 구현 될 수있다). 이 방법은 주로 비드 비터와 96채널 피펫터(그림 2A)와 같은 장비에 대한 초기 투자가 필요하며, 이는 희석 시리즈와 스폿 도금 모두에 필요합니다. 그러나 슬롯형 핀이 있는 96웰 플레이트 복제기를 포함하여 더 저렴한 옵션을 사용할 수 있습니다. 희석 시리즈는 CFU 계수 결과의 정확도에 영향을 미치는 중요한 단계입니다. 고장 모드의 경우, 플라이 부품 또는 유리 비드로 피펫 팁이 막히고 피펫 팁이 피펫터에 제대로 밀봉되지 않거나 다른 이유로 고장날 수 있습니다. 이러한 모든 문제로 인해 영향을받는 우물이 과소 계산되므로 모니터링해야합니다. 희석 시리즈의 각 단계에서 적절한 혼합도 중요합니다. 각 희석액은 플레이트를 플레이트 셰이커에 올려 놓거나 15-20 회 위아래로 피펫 팅하여 철저히 혼합해야하며, 이는 또한 팁을 헹구는 역할을합니다. 가장 희석된 플레이트에서 가장 덜 희석된 플레이트까지 발견함으로써 팁을 전체 희석 시리즈에 재사용할 수 있습니다. 1:2 희석을 사용하면 2-25개의 콜로니 범위에서 계수가 정확하며 수십 배에 걸쳐 있습니다(그림 2C). 따라서 1:10 희석은 시간과 재료를 절약합니다. 활용할 수있는 또 다른 변수는 배양 시간으로, 더 작은 콜로니를 생성하도록 조정할 수 있으므로 인접한 콜로니의 병합을 방지하여 가산 가능한 지점의 범위를 늘릴 수 있습니다.
플레이트의 고품질 사진은 CFU가 분석되고 무기한 보관할 수 있는 원시 소스 데이터가 되기 때문에 필수적입니다. FluoroBox는 한천 표면의 눈부심을 최소화하는 균일한 광도로 플레이트의 사진을 생성하도록 설계되었습니다. 또한 이 설계는 단색 LED 조명과 컬러 사진 필터를 사용하여 형광 콜로니를 선택적으로 촬영할 수 있습니다(그림 3A). 조명 및 카메라 설정이 제어된 FluoroBox와 같은 설정을 구성하면 CFU 이미지의 재현성을 크게 높일 수 있으며, 이는 자동화된 분석에 중요합니다. 콜로니 형태, 형광 강도, 콜로니 성장에 대한 시간 또는 밀도의 영향은 사진을 사용하여 분석할 수 있는 특성 중 일부에 불과합니다. 형광 박테리아를 사용하지 않는 경우 컬러 필터와 단색 조명 없이 포토 박스를 구성할 수 있어 비용과 복잡성이 줄어듭니다. 실험실에서 다른 형광단을 사용하는 경우 여기에서 권장하는 것을 다른 여기등과 방출 필터로 대체할 수 있습니다. 앱을 사용하여 WiFi를 통해 태블릿에 연결된 카메라는 흔들림을 방지하고 데이터 전송을 용이하게 하는 자동 셔터 기능 모두에 유용합니다. 이미지를 태블릿으로 전송한 다음 무선 파일 전송 소프트웨어를 사용하여 노트북으로 전송할 수 있습니다. 이러한 기능을 갖춘 권장 카메라는 재료 표에 표시되어 있습니다.
카운트 온 잇은 ImageJ로 작성된 플러그인입니다. 자동화된 CFU 계수 소프트웨어는 플레이트 이미지를 균일한 96웰 그리드로 분할하고 각 그리드 셀의 콜로니를 계수한 다음 결과를 간단한 스프레드시트로 배치합니다. 플레이트와 사진에서 스폿 격자의 위치에는 항상 차이가 있으므로 사용자는 Croptacular 플러그인을 사용하여 격자를 사진에 수동으로 맞춰야 합니다. 이것은 또한 눈부심이 있는 플레이트 가장자리 근처의 영역을 제외하는 데 도움이 됩니다. 임계값 설정은 이미지에서 가장 정확한 CFU 계수를 얻는 데 중요합니다. 임계값을 너무 높게 설정하면 식민지가 병합됩니다. 임계값을 너무 낮게 설정하면 콜로니가 제외됩니다. 임계값이 설정되면 매크로는 가우시안 블러를 적용하여 가장자리를 부드럽게 하고 앨리어싱을 줄이고, 유역 필터는 겹치는 콜로니를 분할하고, Blob은 파티클 분석을 사용하여 계산됩니다.
때로는 식민지의 밀도가 특정 지점에서 너무 높습니다. Count-On-It은 이를 처리하는 방법을 제공합니다. 부분적으로 병합된 콜로니가 있는 그리드 셀의 콜로니 수를 추정하려면 먼저 전체 플레이트에서 원형 블롭의 평균 면적을 C평균으로 사용합니다. 이어서, 블롭 A1의 면적을 원형 블롭A1/C 평균의평균 면적으로 나눈다. 이 숫자는 가장 가까운 정수로 반올림되며, 이는 Blob에 있는 콜로니 수에 대한 추정치입니다. 이 함수는 임계값이 계산 결과에 영향을 줄 수 있는 한 가지 이유입니다: 상대 평균 콜로니 영역과 병합된 Blob 영역은 임계값이 병합된 Blob에 미치는 영향에 따라 달라집니다.
제시된 방법에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 여기에는 96웰 플레이트에서 액체 매체를 정확하게 분주하기 위한 장비의 필요성이 포함됩니다. 96채널 피펫터 또는 슬롯형 복제기 핀 공구인 이 장비는 구입하는 데 수천 달러의 비용이 들 수 있습니다. 더 저렴한 대안이 존재하지만 정확도는 떨어집니다. Count-On-It을 통한 자동 계산에도 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 예를 들어, 혼합 개체군의 두 콜로니 유형이 크기만으로 구분된 경우 얼룩 계산은 콜로니를 올바른 유형에 할당할 수 없습니다. 이 경우 Blob이 있는 스폿을 개수에서 제거해야 합니다. 형태학에 기초한 콜로니의 추가 차별화는 현재 구현되지 않은 방법의 가치있는 확장이 될 것입니다. 균주 특이적 영양소 및 항생제를 포함한 선택적 배지를 사용하면 복잡한 이미지 분석의 필요성이 간소화됩니다.
96웰 플레이트에서 초파리 실험을 유지하면 단일 실험에서 테스트할 수 있는 샘플 수와 조건이 늘어나고 초파리-박테리아 연관 표현형에서 고처리량 스크린을 용이하게 할 수 있습니다. 우리는 이 방법을 선택적 배지를 사용하여 복잡한 혼합물에서 많은 박테리아 균주를 구별함으로써 확장할 수 있다고 생각합니다. 상기 방법은 플라이 마이크로바이옴의 연구에만 국한되지 않는다. CFU의 정량화는 식수의 대장균군 수에서 병원균 식별에 이르기까지 미생물학의 많은 응용 분야에서 일반적입니다. 여기에 제시된 CFU 도금 시스템은 높은 처리량의 스크린뿐만 아니라 결과의 자동 수집, 처리, 저장 및 전달을 가능하게 합니다.
The authors have nothing to disclose.
Kerwyn Casey Huang 박사, Andrés Aranda-Díaz 박사, Ted Cooper 및 Ludington 연구소 구성원은이 프로토콜의 개발에 귀중한 정보를 제공했습니다. 자금은 NSF IOS 보조금 2032985, NIH 보조금 DP5OD017851, 캐나다 카네기 연구소 보조금 및 카네기 과학 연구소 기부금에서 제공했습니다.
Bead beating and spot plating | |||
Fly vials | Genesee | 32-121 | autoclavable |
Fly vial stoppers | Genesee | 59-201 | autoclavable |
Hand Applicator | 3M | 3M PA1 | |
Heat Sealer | Eppendorf | 5390 | |
Mini-Beadbeater 96 | BioSpec | 1001 | |
Mini-BeadBeater Glass Mill Beads, 0.5 mm | BioSpec | 11079105 | |
MPS 1000 Mini PCR Plate Spinner | Labnet | LI-CF-P1000 | |
Rainin BenchSmart 96 semi-automated pipettor | Mettler Toledo | 30296705 | Less expensive options available, including slotted 96 well pin tool from VP Scientific |
TempPlate semi-skirted 96-well PCR plate, straight skirt, natural | USA scientific | 1402-9220 | Must be polypropylene for heat sealer |
Thermal Bond Heat Seal Foil | 4titude | 4ti-0591 | Keep sterile |
Tray Plate,128 x 85 mm, Polystyrene, Sterile | SPL Life Sciences | 31001 | For making rectangular agar plates |
Photobox construction | |||
¼”-20 X ½” Bolts (X2) | Amazon | ASIN: B07BP1WR3H | To attach the camera bracket. Brand not important. Any 1/4"-20 1/2" bolt works. |
¼”-20 x ½” Connector Nut | Amazon | UPC: 799862376780 | AKA cap nut or connector bolt. This is for attaching the rubber bands on the plate holder. Brand not important. |
¼”-20 x ¾” bolts (X3) | Amazon | ASIN: B003QZSZY4 | For the plate holder. Brand not important. |
1/8” x ½” washer | Amazon | UPC: 611982484599 | Washer for the cap nuts on outside of box. Brand not important. Spray paint black before attaching to blend with the acrylic. |
18 Gauge Wire – Two Conductor Power Wire – 18 AWG Power Wire – 10ft | Superbrightleds.com | WP18-2 | |
22-10 AWG Red Wire Nut – WN-R2210 – Quantity 4 | Superbrightleds.com | WN-R2210 | |
22-18 AWG 3/16in Female Push On Connector – 22-18 AWG – Quantity 3 | Superbrightleds.com | SCFP-2218 | |
4" Solderless Clamp-On Jumper Connector – 8mm Single Color LED Strip Lights – Quantity 3 | Superbrightleds.com | SBL-MA2P-8-2 | |
4" Solderless Clamp-On Pigtail Adaptor – 8mm Single Color LED Strip Lights – Quantity 3 | Superbrightleds.com | SBL-MA2P-8-1 | |
6” drawer handle | Amazon | ASIN: B07Z331P99 | Any drawer handle should work. |
6” Drawer slides | Btibpse | UPC: 712243424979 | Trim the soft close rubber stoppers on the drawer sliders. |
8-32 x ½” Cap Nuts (x4) | Amazon | ASIN: B00HYLZB98 | Attaches drawer slide bolts on outside of box. Brand not important. Nylon won't damage the acrylic. Spray paint black before attaching to blend with the acrylic. |
8-32 x ½” Nylon Bolts (x4) | Amazon | ASIN: B07KX9T7NF | To attach drawer slides. Brand not important. Any bolt or machine screw meeting the specifications works. Nylon won't damage the acrylic and allows you to cut the bolt flush with the nut. Spray paint black before attaching to blend with the acrylic. |
Acrylic Glue | SCIGRIP | Ean: 7844908489337 | SCIGRIP Weld-On #4 Adhesive, Pint and Weld-On Applicator Bottle with Needle |
Black Cable Ties – 10 Pack – 4 Inch Long | Superbrightleds.com | CT-B04-10 | |
Camera L-Bracket | WLPREOE, Vikerer, Unbranded | ASIN: B09X46YKQZ | The bracket should be "reversed" from its intended configuration so that the camera is on the "outside" of the L. Some brackets come in two pieces and allow for this alternate configuration, some don't, you'll need one that can be flipped. Also should have 1/4" holes for attachment. WLPREOE, Vikerer, Unbranded. Amazon Serial Identification Number given as an example. |
Canon T series camera for tethering option OR | Canon, Panasonic, Sony, Nikon, etc.. | 1894C002 | The Canon Ti series cameras are a good option and can tether to a computer. Use with the 18-55mm standard kit lens. Used options are recommended from the Canon T5 to T7 (current model). |
Custom Length Single Color LED Strip Light – Eco Series Tape Light – 24V – IP20 – 250 lm/ft – Blue – 2 meters | Superbrightleds.com | STN-BBLU-B6A-08C1M-24V | |
Custom Length Single Color LED Strip Light – Eco Series Tape Light – 24V – IP20 – 250 lm/ft – Green – 2 meters | Superbrightleds.com | STN-BGRE-B6A-08C1M-24V | |
Custom Length Single Color LED Strip Light – Eco Series Tape Light – 24V – IP20 – 250 lm/ft – Natural White 4000K – 2 meters | Superbrightleds.com | STN-A40K80-B6A-08C1M-24V | |
Drill with ¼”, 1/8” drill bits | Black & Decker | BDCDD12PK | Brand not important. |
Flat Black Spray Paint, 2X Ultra-Matte | Rustoleum | 331182 | Paint the interior of everything FLAT black. Brand not important. |
Laser Cut Acrylic Walls | Big Blue Saw | www.bigbluesaw.com | Use the attached PDF, delete all cutouts in the top piece except desired hole for camera |
Mean Well LED Switching Power Supply – LPV Series 20-100W Single Output LED Power Supply – 24V DC – 20 Watt | Superbrightleds.com | LPV-20-24 | |
Panasonic ZS100 for wifi connection to a phone, tablet, or computer | Canon, Panasonic, Sony, Nikon, etc. | DMC-ZS100K | Panasonic cameras can be wirelessly connected to a computer for data transfer and remote shutter options. Used options are good. |
Quick Release Plate | Neewer Aluminium 50mm Quick Release Plate QR Clamp 3/8-inch with 1/4-inch | ASIN: B07417F21D | Add this to the bracket so the camera can be easily removed for changing color filters. Amazon Serial Identification Number given as an example. |
Rubber Bands, Assorted sizes | BAZIC Products | Alliance Rubber 26649 | Rubber bands go on the plate holder. Brand not important. |
Screw/Adhesive Cable Tie Mounting Bases – 3/4 inch base – Quantity 4 | Superbrightleds.com | CTMB-20 | |
SPST Round Rocker Switch – No LED – Quantity 3 | Superbrightleds.com | RRS-SP | |
Tiffen 29 Filter (Red) 72 mm | Tiffen | 72R29 | |
Tiffen 58 Filter (Green) 72 mm | Tiffen | 7258 | |
Software | |||
ImageJ64 | https://imagej.net/downloads | N/A | Free. Just cite: Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Frise, E., Kaynig, V., Longair, M., Pietzsch, T., … Cardona, A. (2012). Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods, 9(7), 676–682. doi:10.1038/nmeth.2019 |
MacOSX | Apple | N/A | Has a useful batch rename feature in Finder to rename a group of photos to facilitate organizing and analyzing in Count-on-it. |
Unix | BSD | N/A | 64 bit |
Windows | Microsoft | N/A | 64 bit |