비강 자기조립 나노에멀젼 종양백신의 제조, 특성, 독성 및 효능 평가 In Vitro 및 In Vivo

Summary

여기에서는 비강 자가 조립 나노에멀젼 종양 백신의 시험 관 내 및 생체 내 비강 내 진단 및 평가를 위한 자세한 방법을 제시 합니다.

Abstract

에피토프 펩타이드는 안전성, 높은 특이성 및 편리한 생산으로 인해 종양 백신 분야에서 광범위한 관심을 끌었습니다. 특히, 일부 MHC I-제한 에피토프는 종양 세포를 소거하기 위해 효과적인 세포독성 T 림프구 활성을 유도할 수 있다. 또한, 비강 투여는 편의성과 향상된 환자 순응도로 인해 종양 백신에 대한 효과적이고 안전한 전달 기술입니다. 그러나, 에피토프 펩티드는 이들의 면역원성이 낮고 전달 효율이 부족하기 때문에 비강 전달에 적합하지 않다. 나노 에멀젼 (NE)은 항원을 적재하고 비강 점막 표면으로 직접 전달할 수있는 열역학적으로 안정한 시스템입니다. IKVAV(Ile-Lys-Val-Ala-Val)는 인간 호흡기 상피 세포에서 발현되는 인테그린 결합 펩타이드인 라미닌의 핵심 펜타펩타이드입니다. 본 연구에서는 합성 펩타이드 IKVAV-OVA_{257-264 (I-OVA} )를 함유하는 비강내 자가조립 펩타이드 NE 종양 백신을 저에너지 유화법으로 제조하였다. IKVAV와 OVA_257-264 의 조합은 비강 점막 상피 세포에 의한 항원 흡수를 향상시킬 수 있습니다. 여기에서 우리는 투과 전자 현미경 (TEM), 원자력 현미경 (AFM) 및 동적 광 산란 (DLS)에 의한 물리 화학적 특성을 연구하는 프로토콜을 수립합니다. 뮤신 단백질의 존재 하에서의 안정성; BEAS-2B 세포와 C57BL/6 마우스의 비강 및 폐 조직의 세포 생존율을 조사하여 독성; 공초점 레이저 스캐닝 현미경(CLSM)에 의한 세포 흡수; 생체 내에서 작은 동물을 이미징하여 프로파일을 방출합니다. E.G7 종양 보유 모델을 사용하여 백신의 보호 및 치료 효과. 우리는 이 프로토콜이 새로운 T 세포 에피토프 펩타이드 점막 백신의 미래 개발을 위한 기술적, 이론적 단서를 제공할 것으로 기대합니다.

Introduction

가장 중요한 공중 보건 혁신 중 하나인 백신은 전 세계적인 인간 질병 부담과 싸우는 데 핵심적인 역할을 합니다¹. 예를 들어, 현재 COVID-19 질병에 대한 120개 이상의 후보 백신이 테스트되고 있으며 그 중 일부는 많은 국가에서 승인되었습니다². 최근 보고에 따르면 암 백신은 암 환자의 면역체계가 항원을 체내에 이물질로 인식하도록 지시하기 때문에 임상 암 치료의 진행을 효과적으로 개선했다고^{한다 3}. 더욱이, 종양 세포 내부 또는 외부에 위치한 다중 T 세포 에피토프는 펩티드 백신을 설계하는 데 사용될 수 있으며, 이는 방사선 요법 및 화학 요법과 관련된 상당한 독성이 없기 때문에 전이성 암 치료에 이점을 보여주었습니다 ^4,5. 1990년대 중반 이래로 종양 치료를 위한 전임상 및 임상 시험이 주로 항원 펩티드 백신을 사용하여 수행되었으나 암 환자에게 적절한 치료 효과를 나타내는 백신은 거의 없다⁶. 또한, 펩타이드 에피토프를 이용한 암 백신은 면역원성이 낮고 전달 효율이 불충분한데, 이는 투여 부위에서 빠르게 확....

Protocol

동물 실험은 실험동물-동물복지 윤리적 검토 지침(GB/T 35892-2018)에 따라 수행되었으며 제3군의과대학 실험동물복지윤리위원회의 승인을 받았습니다. 마우스는 1% 펜토바르비탈 나트륨 100mg/kg을 복강내 주사하여 안락사시켰다.

1. I-OVA NE의 제조

1. 1mg의 모노포스포릴 지질 A(MPLA)를 100μL의 DMSO와 혼합하고 5분 동안 와동시킨 다음 실온(RT)에서 4시간 동안 방치하여 완전히 용해시킵니다.
2. Tween 80 및 I-OVA를 정량적으로 추가하고 혼합합니다.
   참고: 트윈 80과 I-OVA는 25:1¹⁹의 질량비로 혼합되었습니다.
3. 1.2 단계에서 준비한 혼합물에 스쿠알렌을 첨가합니다 (7 : 3, Smix : 스쿠알렌).
4. 1.3단계에서 제조한 혼합물에 100μL의 MPLA 용액(10mg/mL)을 추가합니다.
5. 저에너지 유화법을 이용하여 나노에멀젼 백신을 제조한다¹⁹: 혼합용액을 전체 부피의 약 70%의 물방울에 첨가하고 부드럽게 저어주어 투명하고 쉽게 유동하는 혼합물을 얻는다.
   참고: BNE 대조군(블랭크 ....

Results

상기 프로토콜에 따라, 비강 종양 나노백신 전달에 대한 in vitro 및 in vivo 실험 평가를 완료하였다. TEM, AFM 및 DLS는 나노백신의 표면 제타 전위와 입자 크기의 기본 특성을 평가하는 효과적인 수단입니다(그림 1). BEAS-2B 상피 세포는 비강 백신의 시험 관 내 독성 시험 에 유용한 스크리닝 모델입니다(그림 2A). H & E로 염색 된 현미경 사진은 I-OVA NE가 조직 손상, 출혈 또는 염증 세포 침윤을 포함한 명백한 점막 독성이 없음을 보여줍니다 (그림 2B). 비강 내 BEAS-2B 세포에 의한 항원의 효율적인 흡수는 후속 면역 반응을 유도하기 위한 항원 제시를 위한 전제 조건입니다(그림 3). IVIS 시스템은 시험관 .......

Discussion

면역세포막으로 기능화된 나노백신은 질병 표적 치료에 큰 이점이 있으며, 독특한 종양 친화성, 특정 표적 식별, 순환 연장, 세포간 상호작용 강화, 낮은 전신 독성 등의 특성으로 부작용이 최소화됩니다. 또한 다른 치료 모듈과 쉽게 통합되어 암을 협력적으로 치료할 수 있습니다^16,20. 바람직한 속성은 측정, 모양 및 전하와 같은 물리적 및 화학적 특성을 제어하여 얻을 수 있습니다. 따라서 나노백신은 광범위한 응용 분야에서 중요해지고 있다²¹. 이러한 특성은 흡수 및 독성에 관한 주요 결정 요인이며, 나노 백신은 조작에 의해서만 무독성이 될 수 있다²². 따라서 모양, 크기 및 전하를 포함한 물리화학적 특성을 연구하기 위한 이 프로토콜은 매우 중요합니다. TEM은 수년 동안 과학계에서 널리 사용되어 온 고정밀 기기입니다

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
96웰 플레이트	Corning Incorporated, USA	CLS3922
Bio-Rad 6.0 마이크로플레이트 리더	Bio-Rad Incorporated Limited Co., CA, USA	Bio-Rad 6.0
CCK-8 키트	일본 도진도	CK04
원심분리기 5810 R	Eppendorf, 독일
DAPI	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	D9542
소 태아 혈청 (FBS)	Hyclone (Life Technology, USA)	SH30088.03
FITC 표지 I-OVA	Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd.
HF 90/240 인큐베이터	Heal Force, 스위스	NA
HPLC	상해 Botai Biotechology Co., 주식 회사.	E2695
도립 현미경	니콘, 일본	DSZ5000X
IPC-208	Chong Qing University, 중국	NA
IVIS 시스템	Caliper Life Science Limited Company	NA
JEM-1230 TEM	JEOL Limited Company of Japan	1230 TEM
Malvern NANO ZS	Malvern Instruments Ltd., UK	NA
MPLA	Invivogen Lit. (주	tlrl-mpla
Neomycin 황산염 연고	상하이 CP General Pharmaceutical Co., Ltd.
OVA257– 264	상하이 Botai 생명공학 Co., Ltd.
RPMI 1640 배지	Hyclone (Life Technology, 미국)	SH30809.01
Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd.	의 합성 펩타이드(I-OVA) 접합
Zeiss LSM800 레이저 스캐닝 컨포칼 형광 현미경	Zeiss, 독일 Zeiss	LSM800