Här beskriver vi en enkel teknik avsedd för effektiv generering av genetiskt modifierade möss som kallas CRISPR RNP Electroporation of Zygotes (CRISPR-EZ). Denna metod levererar redigeringsreagens genom elektroporering till embryon med en effektivitet som närmar sig 100%. Detta protokoll är effektivt för punktmutationer, små genomiska insättningar och deletioner i däggdjursembryon.
Med exceptionell effektivitet, noggrannhet och lätthet har CRISPR / Cas9-systemet avsevärt förbättrat genomredigering i cellodling och laboratoriedjurförsök. Vid generering av djurmodeller erbjuder elektroporering av zygoter högre effektivitet, enkelhet, kostnad och genomströmning som ett alternativ till guldstandardmetoden för mikroinjektion. Elektroporering är också mildare, med högre livskraft, och levererar tillförlitligt Cas9 / single-guide RNA (sgRNA) ribonukleoproteiner (RNP) i zygoterna hos vanliga laboratoriemusstammar (t.ex. C57BL / 6J och C57BL / 6N) som närmar sig 100% leveranseffektivitet. Denna teknik möjliggör infogning/deletion (indels) mutationer, punktmutationer, deletion av hela gener eller exoner och små infogningar i intervallet 100-200 bp för att infoga LoxP eller korta taggar som FLAG, HA eller V5. Samtidigt som vi ständigt förbättras presenterar vi här det aktuella tillståndet för CRISPR-EZ i ett protokoll som inkluderar sgRNA-produktion genom in vitro-transkription, embryobehandling, RNP-montering, elektroporering och genotypning av preimplantatoriska embryon. En forskare på forskarnivå med minimal erfarenhet av att manipulera embryon kan få genetiskt redigerade embryon på mindre än 1 vecka med hjälp av detta protokoll. Här erbjuder vi en enkel, billig, effektiv, högkapacitetsmetod som kan användas med musembryon.
Genomredigering hos levande möss har förenklats avsevärt och har blivit tillgänglig och billigare sedan uppkomsten av CRISPR-redigering 1,2,3. Initiala djurredigeringsförsök använde mikroinjektion för att leverera CRISPR Cas9 mRNA / sgRNA till embryon i pronukleärt stadium 4,5,6. Medan mikroinjektion är ganska effektiv, kanske mängden övning som krävs för att fullt ut behärska det inte är lämpligt för praktikanter och studenter och kräver också dyr utrustning som ett blygsamt finansierat laboratorium inte har råd med. Mikroinjektion utförs normalt av experttekniker vid transgena anläggningar med scheman och servicepriser som är hastighetsbegränsande för många forskare. Ett mer tillgängligt tillvägagångssätt är elektroporering, vilket har visat sig vara ganska effektivt för leverans av CRISPR Cas9 mRNA / sgRNA till embryon i pronukleärt stadium7. Ytterligare förbättringar av CRISPR-genomredigering och leveransstrategier föreslog att förmonterade RNP som redan är engagerade i sgRNA kan vara ett effektivt sätt att minska mosaicism8.
Logiken bakom utvecklingen och användningen av detta protokoll var att kringgå många av de begränsningar och hinder som är förknippade med mikroinjektion. Som namnet antyder skulle en enkel, intern och kostnadseffektiv metod som snabbt kan avgöra om otestade sgRNA-mönster skulle vara värda att använda under ett mikroinjektionsexperiment vara ett mycket bekvämt första pass kvalitetskontrollsteg (figur 1). Även om denna metod inte kan ersätta mikroinjektion för mer komplexa strategier, som att introducera långa donator-DNA-sekvenser för rekombinationsbaserade resultat, är den idealisk för mindre komplexa strategier som små deletioner eller infogningar och taggningsgener. Denna metod är lämplig för forskare med grundläggande embryomanipulationsförmåga som har enkla redigeringsbehov, vill testa sin hypotes inom tidsramen för preimplantatorisk utveckling eller föredrar att testa sgRNA i embryon innan de bokar ett möte med en mikroinjektionsspecialist. Här levereras redigeringsreagens tillfälligt till embryon i pronukleärt stadium som Cas9 / sgRNA RNP via elektroporering (en serie elektriska pulser) för att maximera effektiviteten samtidigt som mosaicism minskar8. Med hjälp av en embryogenotypningsmetod finns redigeringsresultat tillgängliga i cirka 1 vecka9, vilket minskar behovet av olika mikroinjektionsapplikationer till en betydligt lägre kostnad.
Denna metods effektivitet toppar vid det pronukleära embryostadiet, när embryot ännu inte har smält samman moderns och faderns pronuclei eller gått in i S-fas (figur 2). Superovulation används för att maximera antalet zygoter men producerar både pronucleära zygoter och obefruktade ägg. Friska zygoter kan också väljas före elektroporering för att öka den totala effektiviteten. Eftersom andra elektroporeringsprotokoll effektivt har redigerat zygoter utan att behöva inkludera ett liknande steg 7,10,11,12,13,14,15, är ett valfritt steg i detta protokoll den lilla erosionen av zona pellucida (ZP). ZP är ett glykoproteinskikt som hjälper spermatozoabindning, akrosomrespons och befruktning kring embryon i pronukleärt stadium. Enligt vår erfarenhet fann vi att en mild syrabaserad erosion av ZP ger tillförlitlig Cas9 RNP-elektroporeringsleverans med endast en marginell inverkan på livskraften.
Vi har observerat RNP-leveranshastigheter på upp till 100% effektivitet via elektroporering i musstammar som vanligtvis används i forskning som C57BL / 6J och C57BL / 6N 9,16. Oberoende grupper har också utvecklat elektroporeringsbaserade procedurer med effektivitet större än eller matchande mikroinjektion 11,12,13,14,15,17, med elektroporeringsprotokoll som fungerar bra hos råtta18,19, gris 20,21,22 och ko 23 , så vi föreslår att läsarna jämför protokollen för att hitta de förhållanden som bäst passar deras experimentella och utrustningsbehov. Systemet som beskrivs här använder vanliga material och utrustning, vilket endast kräver grundläggande embryomanipulationsfärdigheter. Denna teknik är effektiv för en rad redigeringsstrategier, vilket gör denna metod allmänt tillgänglig för forskarsamhället.
Att designa ideala små guide-RNA (sgRNA) är avgörande för effektiv redigering. Vi rekommenderar screening av två till tre sgRNA-strategier per målplats direkt i musembryon, särskilt om muslinjegenerering önskas. När de väl är utformade rekommenderas kloningsfria metoder som in vitro-transkription (IVT) för att producera högkvalitativa sgRNA3. RNP och sgRNA blandas med 30-50 bearbetade embryon i pronukleärt stadium och utsätts för en serie elektriska pulser för att först tillfälligt permeabilisera ZP och cellmembranet, med efterföljande pulser för att hålla porerna öppna och elektrofores RNP genom zygoten24. Efter optimering fann vi att sex 3 ms pulser vid 30 V för bulkembryon (~ 50) var optimala för redigeringseffektivitet och livskraft, vilket gav mycket effektiv Cas9 / sgRNA RNP-leverans 9,16,25. Redigeringshändelser i enskilda musmorula kan bekräftas med hjälp av en mängd olika valideringsstrategier som är vanliga för CRISPR-redigering, såsom restriktionsfragmentlängdspolymorfism (RFLP), T7-endonukleassmältning och Sanger-sekvensering av området av intresse26.
Den nuvarande metoden är mest lämplig för enkla redigeringsscheman (figur 3), såsom infogning/raderingar (indels), exon-stora raderingar i storleksordningen 500-2000 bp och leverans av punktmutationer och små infogningar som C- eller N-terminaltaggar (t.ex. FLAG, HA eller V5)9,16,27. Potentialen för komplex genomredigering, som stora infogningar av fluorescerande taggar eller villkorade alleler, är fortfarande osäker och är för närvarande fokus för kommande förbättringar.
Denna metod är lätt att bemästra och kan användas för att snabbt testa sgRNA i odlade musembryon i 1 vecka9 (figur 1). I detta arbete presenteras ett sexstegsprotokoll, som inkluderar 1) sgRNA-design; 2) sgRNA-syntes; 3) superovulation och parning; 4) embryoodling, insamling och bearbetning; 5) RNP-montering och elektroporering; 6) embryoodling och genotypning. Information om alla material som används tillhandahålls (Materialförteckning). Som en positiv kontroll har reagenser för att redigera tyrosinas (Tyr) lokus 9,16 tagits med i tilläggstabell 1.
Här presenteras en enkel och mycket effektiv redigeringsteknik för musgenom. Elektroporering kan användas för att generera modifierade embryon på 1-2 veckor (figur 1) och kan producera redigerade möss inom 6 veckor9. Jämfört med samtidigt utvecklade elektroporeringsbaserade protokoll som levererar RNP 7,10,11,12,13,14,15,17,32, är metoden som beskrivs här konceptuellt likartad och erbjuder effektivitet i samma intervall<sup class="xre…
The authors have nothing to disclose.
A.J.M. skapade det ursprungliga konceptet som ledde till utvecklingen av CRISPR-EZ och producerade figurerna. C.K.D. sammanställde och anpassade de interna och publicerade protokollen för detta aktuella manuskript. A.J.M. stöds av NIH (R00HD096108).
0.1-cm-gap electroporation cuvette | Bio-Rad | cat. no. 1652089 | Electroporation |
26-G, 1/2-inch needle | BD | cat. no. 305111 | Superovulation |
3–8-month-old male mice and 3- to 5-week-old female mice | JAX | cat. no. 000664 | Superovulation |
35-mm Tissue culture dish | Greiner Bio-One, | cat. no. 627-160 | Embryo Culture |
60-mm Tissue culture dish | Greiner Bio-One, | cat. no. 628-160 | Embryo Processing |
6x loading dye | Thermo Fisher Scientific | cat. no. R0611 | sgRNA Synthesis and Genotyping |
Acidic Tyrode's (AT) solution, embryo culture grade | Sigma-Aldrich, | cat. no. T1788 | Embryo Processing |
BSA, embryo culture grade | Sigma-Aldrich | cat. no. A3311 | Embryo Processing and Culture |
Cas9 protein | Alt-R S.p. Cas9 nuclease 3NLS | cat. no. 1074181 | Electroporation |
DNase I, RNase-free | New England BioLabs, | cat. no. M0303 | sgRNA Synthesis |
DPBS(calcium and magnesium free) | Gibco | cat. no. 14190-144 | Embryo Processing |
EcoRI | NEB | cat. no. R3101S | Genotyping |
EDTA, anhydrous | Sigma-Aldrich | cat. no. EDS-100G | RNP Buffer |
Ethanol | Koptec | cat. no. V1016 | sgRNA Synthesis |
Gelatin (powder) type B, laboratory grade | Fisher, | cat. no. G7-500 | Lysis Buffer |
Glycerol, molecular-biology grade | Fisher | cat. no. BP229 | RNP Buffer |
Taq Polymerase | Promega | cat. no. M712 | Genotyping |
HEPES, cell culture grade | Sigma-Aldrich | cat. no. H4034 | RNP Buffer |
HinfI (10,000 U/mL) | NEB | cat. no. R0155S | Genotyping |
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit | New England BioLabs, | cat. no. E2040 | sgRNA Synthesis |
Human chorion gonadotropin, lyophilized (hCG) | Millipore | cat. no. 230734 | Superovulation |
Hyaluronidase/M2 | Millipore | cat. no. MR-051-F | Embryo Processing |
KSOMaa Evolve medium (potassium-supplemented simplex-optimized medium plus amino acids) | Zenith Biotech | cat. no. ZEKS-050 | Embryo Culture |
LE agarose, analytical grade | BioExpress | cat. no. E-3120-500 | sgRNA Synthesis and Genotyping |
M2 medium | Zenith Biotech | cat. no. ZFM2-050 | Embryo Processing |
Magnesium chloride, anhydrous (MgCl2) | Sigma-Aldrich | cat. no. M8266 | RNP and Lysis Buffer |
Mineral Oil | Millipore | cat. no. ES-005C | Embryo Culture |
Nonidet P-40,substitute (NP-40) | Sigma-Aldrich | cat. no. 74385 | Lysis Buffer |
Nuclease-free water, molecular-biology grade | Ambion | cat. no. AM9937 | sgRNA Synthesis and Genotyping |
Oligos for sgRNA synthesis, donor oligo and PCR primers for genotyping | Integrated DNA Technologies | custom orders | sgRNA Design |
Reduced serum medium | Thermo Fisher Scientific | cat. no. 31985062 | Embryo Culture |
High-fidelity DNA polymerase | New England BioLabs, | cat. no. M0530 | sgRNA Synthesis |
Potassium chloridemolecular-biology grade (KCl) | Sigma-Aldrich | cat. no. P9333 | RNP and Lysis Buffer |
Pregnant mare serum gonadotropin lyophilizd ((PMSG) | ProspecBio | cat. no. HOR-272 | Superovulation |
Proteinase K, molecular-biology grade | Fisher | cat. no. BP1700-100 | Lysis Buffer |
RNase-free 1.5-mL microcentrifuge tube | VWR | cat. no. 20170-333 | sgRNA Synthesis and Genotyping |
RNase-free eight-well PCR strip tubes | VWR | cat. no. 82006-606 | sgRNA Synthesis and Genotyping |
Magnetic purification beads | GE Healthcare | cat. no. 65152105050250 | sgRNA Synthesis |
Tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP) | Sigma-Aldrich | cat. no. C4706 | RNP Buffer |
Tris-HCl solution, pH 8.5 molecular-biology grade | Teknova | cat. no. T1085 | Lysis Buffer |
Tween 20 molecular-biology grade | Sigma-Aldrich | cat. no. P7949-500 | Lysis Buffer |