Efficiënte genoombewerking van muizen door CRISPR-elektroporatie van zygoten

Summary

Hier beschrijven we een eenvoudige techniek die bedoeld is voor de efficiënte generatie van genetisch gemodificeerde muizen, CRISPR RNP Electroporation of Zygotes (CRISPR-EZ). Deze methode levert bewerkingsreagentia door elektroporatie in embryo’s met een efficiëntie van bijna 100%. Dit protocol is effectief voor puntmutaties, kleine genomische inserties en deleties in zoogdierembryo’s.

Abstract

Met uitzonderlijke efficiëntie, nauwkeurigheid en gemak heeft het CRISPR/Cas9-systeem de genoombewerking in celkweek en proefdierproeven aanzienlijk verbeterd. Bij het genereren van diermodellen biedt de elektroporatie van zygoten een hogere efficiëntie, eenvoud, kosten en doorvoer als alternatief voor de gouden standaardmethode van micro-injectie. Elektroporatie is ook zachter, met een hogere levensvatbaarheid, en levert op betrouwbare wijze Cas9/ single-guide RNA (sgRNA) ribonucleoproteïnen (RRP’s) in de zygoten van gewone laboratoriummuisstammen (bijv. C57BL / 6J en C57BL / 6N) die 100% leveringsefficiëntie benaderen. Deze techniek maakt insertie/deletie (indels) mutaties, puntmutaties, de deletie van hele genen of exonen en kleine inserties in het bereik van 100-200 bp mogelijk om LoxP of korte tags zoals FLAG, HA of V5 in te voegen. Hoewel voortdurend wordt verbeterd, presenteren we hier de huidige staat van CRISPR-EZ in een protocol dat sgRNA-productie omvat door in vitro transcriptie, embryoverwerking, RNP-assemblage, elektroporatie en de genotypering van pre-implantatieembryo’s. Een onderzoeker op graduate niveau met minimale ervaring in het manipuleren van embryo’s kan genetisch bewerkte embryo’s verkrijgen in minder dan 1 week met behulp van dit protocol. Hier bieden we een eenvoudige, goedkope, efficiënte methode met hoge capaciteit die kan worden gebruikt met muizenembryo’s.

Introduction

Genoombewerking bij levende muizen is aanzienlijk vereenvoudigd en is toegankelijker en betaalbaarder geworden sinds de opkomst van CRISPR-bewerking ^1,2,3. Initiële bewerkingspogingen bij dieren gebruikten micro-injectie om CRISPR Cas9-mRNA/sgRNA af te leveren in embryo’s in het pronucleaire stadium ^4,5,6. Hoewel micro-injectie vrij effectief is, is de hoeveelheid oefening die nodig is om het volledig onder de knie te krijgen misschien niet geschikt voor stagiairs en studenten en vereist het ook dure apparatuur die een bescheiden gefinancierd laboratorium zich niet kan veroorloven. Micro-injectie wordt normaal gesproken uitgevoerd door deskundige technici in transgene faciliteiten met schema’s en serviceprijzen die voor veel onderzoekers snelheidsbeperkend zijn. Een meer toegankelijke benadering is die van elektroporatie, waarvan is aangetoond dat deze vrij effectief is voor de afgifte van CRISPR Cas9-mRNA / sgRNA in embryo’s in het pronucleaire stadium⁷. Verdere verbeteringen in CRISPR-genoombewerkings- en leveringsstrategieën suggereerden dat voorgeassembleerde RRP’s die al betrokken zijn bij sgRNA’s een effectief middel kunnen zijn om mozaïcisme te verminderen⁸.

De reden achter de ontwikkeling en het gebruik van dit protocol was om veel van de beperkingen en obstakels in verband met micro-injectie te omzeilen. Zoals de naam al aangeeft, zou een eenvoudige, interne en kosteneffectieve methode die snel zou kunnen bepalen of niet-geteste sgRNA-ontwerpen de moeite waard zouden zijn om te gebruiken tijdens een micro-injectie-experiment, een zeer handige first pass kwaliteitscontrolestap zijn (figuur 1). Hoewel deze methode micro-injectie niet kan vervangen voor complexere strategieën, zoals het introduceren van lange donor-DNA-sequenties voor op recombinatie gebaseerde uitkomsten, is het ideaal voor minder complexe strategieën zoals kleine deleties of inserties en tagginggenen. Deze methode is geschikt voor onderzoekers met elementaire embryomanipulatievaardigheden die eenvoudige bewerkingsbehoeften hebben, hun hypothese willen testen binnen het tijdsbestek van pre-implantatieontwikkeling, of liever sgRNA’s in embryo’s testen voordat ze een afspraak plannen met een micro-injectiespecialist. Hier worden bewerkingsreagentia tijdelijk afgeleverd in embryo’s in het pronucleaire stadium als Cas9 / sgRNA RNPs via elektroporatie (een reeks elektrische pulsen) om de efficiëntie te maximaliseren en tegelijkertijd het mozaïcisme te verminderen⁸. Met behulp van een embryogenotyperingsmethode zijn bewerkingsresultaten beschikbaar in ongeveer 1 week⁹, waardoor de behoefte aan verschillende micro-injectietoepassingen tegen aanzienlijk lagere kosten wordt verminderd.

De effectiviteit van deze methode piekt in het pronucleaire embryostadium, wanneer het embryo de maternale en vaderlijke pronuclei nog niet heeft gefuseerd of in de S-fase is gekomen (figuur 2). Superovulatie wordt gebruikt om het aantal zygoten te maximaliseren, maar produceert zowel pronucleaire zygoten als onbevruchte eieren. Gezonde zygoten kunnen ook vooraf worden geselecteerd vóór elektroporatie om de algehele efficiëntie te verhogen. Aangezien andere elektroporatieprotocollen efficiënt bewerkte zygoten hebben zonder de noodzaak om een vergelijkbare stap 7,10,11,12,13,14,15 op te nemen, is een optionele stap van dit protocol de lichte erosie van de zona pellucida (ZP). De ZP is een glycoproteïnelaag die spermatozoabinding, acrosoomrespons en bevruchting rond embryo’s in het pronucleaire stadium helpt. In onze ervaring ontdekten we dat een zachte op zuur gebaseerde erosie van de ZP een betrouwbare Cas9 RNP-elektroporatieafgifte biedt met slechts een marginale impact op de levensvatbaarheid.

We hebben RNP-toedieningspercentages tot 100% efficiëntie waargenomen via elektroporatie in muizenstammen die vaak worden gebruikt in onderzoek zoals C57BL / 6J en C57BL / 6N ^9,16. Onafhankelijke groepen hebben ook op elektroporatie gebaseerde procedures ontwikkeld met efficiënties groter dan of overeenkomend met micro-injectie 11,12,13,14,15,17, waarbij elektroporatieprotocollen goed functioneren bij rat ^18,19, varken 20,21,22 en koe 23 , dus we raden lezers aan de protocollen te vergelijken om de omstandigheden te vinden die het beste passen bij hun experimentele en apparatuurbehoeften. Het hier beschreven systeem maakt gebruik van gemeenschappelijke materialen en apparatuur, waarvoor alleen elementaire embryomanipulatievaardigheden nodig zijn. Deze techniek is effectief voor een reeks bewerkingsstrategieën, waardoor deze methode breed toegankelijk is voor de onderzoeksgemeenschap.

Het ontwerpen van ideale kleine gids-RNA’s (sgRNA’s) is essentieel voor efficiënte bewerking. We raden aan om twee tot drie sgRNA-strategieën per doellocatie direct in muizenembryo’s te screenen, vooral als het genereren van muizenlijnen gewenst is. Eenmaal ontworpen, worden kloonvrije methoden zoals in vitro transcriptie (IVT) aanbevolen om hoogwaardige sgRNA’s te produceren³. De RRP’s en sgRNA’s worden gemengd met 30-50 verwerkte embryo’s in het pronucleaire stadium en blootgesteld aan een reeks elektrische pulsen om eerst tijdelijk het ZP- en celmembraan te doordringen, met daaropvolgende pulsen om de poriën open te houden en de RRP’s door de zygote²⁴ te elektroforeren. Na optimalisatie ontdekten we dat zes pulsen van 3 ms bij 30 V voor bulkembryo’s (~ 50) optimaal waren voor het bewerken van effectiviteit en levensvatbaarheid, waardoor zeer efficiënte Cas9 / sgRNA RNP-afgifte ^{9,16,25 werd} geboden. Bewerkingsgebeurtenissen in individuele muismorula kunnen worden bevestigd met behulp van een verscheidenheid aan validatiestrategieën die gebruikelijk zijn voor CRISPR-bewerking, zoals restrictief fragmentlengtepolymorfisme (RFLP), T7-endonucleasevertering en Sanger-sequencing van het interessegebied²⁶.

De huidige methode is het meest geschikt voor eenvoudige bewerkingsschema’s (figuur 3), zoals insertie/deleties (indels), exon-formaat deleties in de orde van 500-2000 bp, en de levering van puntmutaties en kleine inserties zoals C- of N-Terminal-tags (bijv. FLAG, HA of V5)^9,16,27. Het potentieel voor complexe genoombewerking, zoals grote inserties van fluorescerende tags of voorwaardelijke allelen, blijft onzeker en is de huidige focus van aankomende verbeteringen.

Deze methode is gemakkelijk onder de knie te krijgen en kan worden gebruikt om sgRNA’s snel te testen in gekweekte muizenembryo’s in 1 week⁹ (figuur 1). Gepresenteerd in dit werk is een zesstappenprotocol, dat 1) sgRNA-ontwerp omvat; 2) sgRNA-synthese; 3) superovulatie en paring; 4) embryocultuur, -verzameling en -verwerking; 5) RNP-assemblage en elektroporatie; 6) embryocultuur en genotypering. Informatie over alle gebruikte materialen wordt verstrekt (Tabel van materialen). Als positieve controle zijn reagentia voor het bewerken van de Tyrosinase (Tyr) locus ^9,16 opgenomen in de aanvullende tabel 1.

Protocol

Alle dierverzorging en -gebruik in dit protocol hielden zich aan het beleid van de Animal Welfare Act, de ILAR Guide for Care and Use of Laboratory Animals en volgden de richtlijnen en het beleid van de AVMA voor euthanasie en de University of Pennsylvania Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Het protocol voor dierverzorging en -gebruik werd beoordeeld en goedgekeurd door de IACUC van de Universiteit van Pennsylvania voor dit project. Als een kwestie van naleving en voorzichtigheid, vraag dan alle benodig…

Representative Results

Deze methode genereert meer dan 100 μgg sgRNA (20 μL bij >6.000 ng/L concentratie) voor een efficiënte Cas9/sgRNA RNP assemblage. De hier beschreven routinematige superovulatiemethode produceert meestal 10-20 levensvatbare embryo’s per geplugd vrouwtje. Als gevolg van hanteringsfouten en typische verliezen in verband met embryomanipulatie, is naar verwachting 80% van de embryo’s bevrucht, levensvatbaar en in uitstekende staat na elektroporatie. Om onderzoekers te helpen bij het uitvoeren van een succesvol experiment, …

Discussion

Hier wordt een eenvoudige en zeer efficiënte technologie voor het bewerken van het muizengenoom gepresenteerd. Elektroporatie kan worden gebruikt om gemodificeerde embryo’s te genereren in 1-2 weken (figuur 1) en kan binnen 6 weken bewerkte muizen produceren⁹. Vergeleken met gelijktijdig ontwikkelde op elektroporatie gebaseerde protocollen die RNPs ^{7,10,11,12,13,14,15,17,32}<s…

Materials

0.1-cm-gap electroporation cuvette	Bio-Rad	cat. no. 1652089	Electroporation
26-G, 1/2-inch needle	BD	cat. no. 305111	Superovulation
3–8-month-old male mice and 3- to 5-week-old female mice	JAX	cat. no. 000664	Superovulation
35-mm Tissue culture dish	Greiner Bio-One,	cat. no. 627-160	Embryo Culture
60-mm Tissue culture dish	Greiner Bio-One,	cat. no. 628-160	Embryo Processing
6x loading dye	Thermo Fisher Scientific	cat. no. R0611	sgRNA Synthesis and Genotyping
Acidic Tyrode's (AT) solution, embryo culture grade	Sigma-Aldrich,	cat. no. T1788	Embryo Processing
BSA, embryo culture grade	Sigma-Aldrich	cat. no. A3311	Embryo Processing and Culture
Cas9 protein	Alt-R S.p. Cas9 nuclease 3NLS	cat. no. 1074181	Electroporation
DNase I, RNase-free	New England BioLabs,	cat. no. M0303	sgRNA Synthesis
DPBS(calcium and magnesium free)	Gibco	cat. no. 14190-144	Embryo Processing
EcoRI	NEB	cat. no. R3101S	Genotyping
EDTA, anhydrous	Sigma-Aldrich	cat. no. EDS-100G	RNP Buffer
Ethanol	Koptec	cat. no. V1016	sgRNA Synthesis
Gelatin (powder) type B, laboratory grade	Fisher,	cat. no. G7-500	Lysis Buffer
Glycerol, molecular-biology grade	Fisher	cat. no. BP229	RNP Buffer
Taq Polymerase	Promega	cat. no. M712	Genotyping
HEPES, cell culture grade	Sigma-Aldrich	cat. no. H4034	RNP Buffer
HinfI (10,000 U/mL)	NEB	cat. no. R0155S	Genotyping
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit	New England BioLabs,	cat. no. E2040	sgRNA Synthesis
Human chorion gonadotropin, lyophilized (hCG)	Millipore	cat. no. 230734	Superovulation
Hyaluronidase/M2	Millipore	cat. no. MR-051-F	Embryo Processing
KSOMaa Evolve medium (potassium-supplemented simplex-optimized medium plus amino acids)	Zenith Biotech	cat. no. ZEKS-050	Embryo Culture
LE agarose, analytical grade	BioExpress	cat. no. E-3120-500	sgRNA Synthesis and Genotyping
M2 medium	Zenith Biotech	cat. no. ZFM2-050	Embryo Processing
Magnesium chloride, anhydrous (MgCl2)	Sigma-Aldrich	cat. no. M8266	RNP and Lysis Buffer
Mineral Oil	Millipore	cat. no. ES-005C	Embryo Culture
Nonidet P-40,substitute (NP-40)	Sigma-Aldrich	cat. no. 74385	Lysis Buffer
Nuclease-free water, molecular-biology grade	Ambion	cat. no. AM9937	sgRNA Synthesis and Genotyping
Oligos for sgRNA synthesis, donor oligo and PCR primers for genotyping	Integrated DNA Technologies	custom orders	sgRNA Design
Reduced serum medium	Thermo Fisher Scientific	cat. no. 31985062	Embryo Culture
High-fidelity DNA polymerase	New England BioLabs,	cat. no. M0530	sgRNA Synthesis
Potassium chloridemolecular-biology grade (KCl)	Sigma-Aldrich	cat. no. P9333	RNP and Lysis Buffer
Pregnant mare serum gonadotropin lyophilizd ((PMSG)	ProspecBio	cat. no. HOR-272	Superovulation
Proteinase K, molecular-biology grade	Fisher	cat. no. BP1700-100	Lysis Buffer
RNase-free 1.5-mL microcentrifuge tube	VWR	cat. no. 20170-333	sgRNA Synthesis and Genotyping
RNase-free eight-well PCR strip tubes	VWR	cat. no. 82006-606	sgRNA Synthesis and Genotyping
Magnetic purification beads	GE Healthcare	cat. no. 65152105050250	sgRNA Synthesis
Tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP)	Sigma-Aldrich	cat. no. C4706	RNP Buffer
Tris-HCl solution, pH 8.5 molecular-biology grade	Teknova	cat. no. T1085	Lysis Buffer
Tween 20 molecular-biology grade	Sigma-Aldrich	cat. no. P7949-500	Lysis Buffer