Effiziente Genom-Editierung von Mäusen durch CRISPR-Elektroporation von Zygoten

Summary

Hier beschreiben wir eine einfache Technik zur effizienten Erzeugung von genetisch veränderten Mäusen namens CRISPR RNP Electroporation of Zygotes (CRISPR-EZ). Diese Methode liefert Editierreagenzien durch Elektroporation in Embryonen mit einer Effizienz von nahezu 100%. Dieses Protokoll ist wirksam bei Punktmutationen, kleinen genomischen Insertionen und Deletionen in Säugetierembryonen.

Abstract

Mit außergewöhnlicher Effizienz, Genauigkeit und Leichtigkeit hat das CRISPR/Cas9-System die Genom-Editierung in Zellkultur- und Labortierversuchen deutlich verbessert. Bei der Erstellung von Tiermodellen bietet die Elektroporation von Zygoten eine höhere Effizienz, Einfachheit, Kosten und einen höheren Durchsatz als Alternative zur Goldstandardmethode der Mikroinjektion. Die Elektroporation ist auch schonender, mit höherer Lebensfähigkeit und liefert zuverlässig Cas9 / Single-Guide-RNA (sgRNA) Ribonukleoproteine (RNPs) in die Zygoten gängiger Labormausstämme (z. B. C57BL / 6J und C57BL / 6N), die eine 100%ige Liefereffizienz erreichen. Diese Technik ermöglicht Insertions-/Deletionsmutationen (Indels), Punktmutationen, die Deletion ganzer Gene oder Exons und kleine Insertionen im Bereich von 100-200 bp, um LoxP oder kurze Tags wie FLAG, HA oder V5 einzufügen. Während es ständig verbessert wird, präsentieren wir hier den aktuellen Stand von CRISPR-EZ in einem Protokoll, das die sgRNA-Produktion durch In-vitro-Transkription , Embryo-Prozessierung, RNP-Assemblierung, Elektroporation und die Genotypisierung von Präimplantationsembryonen umfasst. Ein Forscher mit minimaler Erfahrung in der Manipulation von Embryonen kann mit diesem Protokoll in weniger als 1 Woche genetisch veränderte Embryonen erhalten. Hier bieten wir eine einfache, kostengünstige, effiziente und leistungsfähige Methode an, die mit Mausembryonen verwendet werden könnte.

Introduction

Die Genom-Editierung bei lebenden Mäusen wurde erheblich vereinfacht und ist seit dem Aufkommen der CRISPR-Editierung^{zugänglicher} und erschwinglicher geworden ^1,2,3. Erste Versuche zur Bearbeitung von Tieren verwendeten Mikroinjektionen, um CRISPR Cas9 mRNA / sgRNA in Embryonen im Pronuklearstadium zu liefern ^4,5,6. Während die Mikroinjektion sehr effektiv ist, ist die Menge an Übung, die erforderlich ist, um sie vollständig zu beherrschen, möglicherweise nicht für Auszubildende und Studenten geeignet und erfordert auch teure Geräte, die sich ein bescheiden finanziertes Labor nicht leisten kann. Die Mikroinjektion wird in der Regel von erfahrenen Technikern in transgenen Anlagen mit Zeitplänen und Servicepreisen durchgeführt, die für viele Forscher preisbegrenzend sind. Ein zugänglicherer Ansatz ist die Elektroporation, die sich als sehr effektiv für die Verabreichung von CRISPR-Cas9-mRNA / sgRNA in Embryonen im Pronuklearstadium erwiesen hat⁷. Weitere Verbesserungen bei der Genom-Editierung und den Verabreichungsstrategien von CRISPR deuten darauf hin, dass vorkonfektionierte RNPs, die bereits mit sgRNAs verbunden sind, ein wirksames Mittel zur Verringerung des Mosaizismus sein könnten⁸.

Der Grund für die Entwicklung und Verwendung dieses Protokolls bestand darin, viele der Einschränkungen und Hindernisse zu umgehen, die mit der Mikroinjektion verbunden sind. Wie der Name schon sagt, wäre eine einfache, hauseigene und kostengünstige Methode, mit der schnell festgestellt werden kann, ob sich ungetestete sgRNA-Designs während eines Mikroinjektionsexperiments lohnen, ein sehr praktischer Schritt zur Qualitätskontrolle im ersten Durchgang (Abbildung 1). Während diese Methode die Mikroinjektion für komplexere Strategien, wie die Einführung langer Spender-DNA-Sequenzen für rekombinationsbasierte Ergebnisse, nicht ersetzen kann, ist sie ideal für weniger komplexe Strategien wie kleine Deletionen oder Insertionen und die Markierung von Genen. Diese Methode eignet sich für Forscher mit grundlegenden Fähigkeiten in der Manipulation von Embryonen, die einfache Bearbeitungsbedürfnisse haben, ihre Hypothese innerhalb des Zeitrahmens der Präimplantationsentwicklung testen möchten oder es vorziehen, sgRNAs in Embryonen zu testen, bevor sie einen Termin mit einem Mikroinjektionsspezialisten vereinbaren. Hier werden Editierreagenzien vorübergehend als Cas9 / sgRNA-RNPs über Elektroporation (eine Reihe elektrischer Impulse) in Embryonen im pronuklearen Stadium eingebracht, um die Effizienz zu maximieren und gleichzeitig den Mosaikismus zu verringern⁸. Unter Verwendung einer Embryonen-Genotypisierungsmethode liegen die Bearbeitungsergebnisse in ca. 1 Woche⁹ vor, wodurch der Bedarf an verschiedenen Mikroinjektionsanwendungen zu deutlich reduzierten Kosten reduziert wird.

Die Wirksamkeit dieser Methode erreicht ihren Höhepunkt im pronukleären Embryostadium, wenn der Embryo noch nicht mit den mütterlichen und väterlichen Vorkernen verschmolzen ist oder in die S-Phase eingetreten ist (Abbildung 2). Superovulation wird verwendet, um die Anzahl der Zygoten zu maximieren, produziert aber sowohl pronukleäre Zygoten als auch unbefruchtete Eier. Gesunde Zygoten können auch vor der Elektroporation vorselektiert werden, um die Gesamteffizienz zu erhöhen. Da andere Elektroporationsprotokolle Zygoten effizient editiert haben, ohne dass ein ähnlicher Schritt 7,10,11,12,13,14,15 erforderlich ist^, ist ein optionaler Schritt dieses Protokolls die leichte Erosion der Zona pellucida (ZP). Das ZP ist eine Glykoproteinschicht, die die Bindung von Spermatozoen, die Akrosomenreaktion und die Befruchtung von Embryonen im Pronuklearstadium unterstützt. Nach unserer Erfahrung haben wir festgestellt, dass eine sanfte säurebasierte Erosion des ZP eine zuverlässige Cas9-RNP-Elektroporation mit nur marginalen Auswirkungen auf die Lebensfähigkeit bietet.

Wir haben RNP-Lieferraten von bis zu 100% Effizienz durch Elektroporation in Mausstämmen beobachtet, die häufig in der Forschung verwendet werden, wie C57BL / 6J und C57BL / 6N ^9,16. Unabhängige Gruppen haben auch auf Elektroporation basierende Verfahren entwickelt, deren Wirkungsgrade größer oder gleich denen der Mikroinjektion 11, 12, 13, ^{14, 15}, 17 sind, wobei die Elektroporationsprotokolle bei Ratten¹⁸, ¹⁹, Schweinen 20,^{21, 22} und Kühen ²³ gut funktionieren Daher empfehlen wir den Lesern, die Protokolle zu vergleichen, um die Bedingungen zu finden, die ihren Experimentier- und Ausrüstungsanforderungen am besten entsprechen. Das hier beschriebene System verwendet gängige Materialien und Geräte, die nur grundlegende Fähigkeiten zur Manipulation von Embryonen erfordern. Diese Technik ist für eine Reihe von Bearbeitungsstrategien wirksam und macht diese Methode für die Forschungsgemeinschaft allgemein zugänglich.

Das Design idealer Small-Guide-RNAs (sgRNAs) ist für eine effiziente Bearbeitung unerlässlich. Wir empfehlen, zwei bis drei sgRNA-Strategien pro Zielort direkt in Mausembryonen zu screenen, insbesondere wenn die Generierung von Mauslinien gewünscht wird. Einmal entwickelt, werden klonenfreie Methoden wie die In-vitro-Transkription (IVT) zur Herstellung hochwertiger sgRNAs empfohlen³. Die RNPs und sgRNAs werden mit 30-50 prozessierten Embryonen im Pronuklearstadium gemischt und einer Reihe von elektrischen Impulsen ausgesetzt, um zuerst vorübergehend die ZP und die Zellmembran zu permeabilisieren, mit nachfolgenden Impulsen, um die Poren offen zu halten und die RNPs durch die Zygote²⁴ zu elektrophorisieren. Nach der Optimierung fanden wir heraus, dass sechs 3-ms-Impulse bei 30 V für Massenembryonen (~ 50) optimal für die Editiereffektivität und Lebensfähigkeit waren und eine hocheffiziente Cas9 / sgRNA-RNP-Lieferung ^9,16,25 ermöglichten. Editierereignisse in einzelnen Mausmorula können mit einer Vielzahl von Validierungsstrategien bestätigt werden, die für die CRISPR-Bearbeitung üblich sind, wie z. B. Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (RFLP), T7-Endonuklease-Verdauung und Sanger-Sequenzierung der interessierenden Region²⁶.

Die aktuelle Methode eignet sich am besten für einfache Bearbeitungsschemata (Abbildung 3), wie z. B. Einfügungen/Löschungen (Indels), Exon-große Löschungen in der Größenordnung von 500-2000 bp und die Bereitstellung von Punktmutationen und kleinen Insertionen wie C- oder N-Terminal-Tags (z. B. FLAG, HA oder V5)^9,16,27. Das Potenzial für komplexe Genom-Editierung, wie große Insertionen von Fluoreszenz-Tags oder bedingten Allelen, bleibt ungewiss und steht derzeit im Fokus bevorstehender Verbesserungen.

Diese Methode ist leicht zu beherrschen und kann verwendet werden, um sgRNAs in kultivierten Mausembryonen in 1 Woche⁹ schnell zu testen (Abbildung 1). In dieser Arbeit wird ein sechsstufiges Protokoll vorgestellt, das 1) sgRNA-Design; 2) sgRNA-Synthese; 3) Superovulation und Paarung; 4) Embryonenkultur, -entnahme und -verarbeitung; 5) RNP-Montage und Elektroporation; 6) Embryokultur und Genotypisierung. Informationen über alle verwendeten Materialien werden zur Verfügung gestellt (Materialtabelle). Als Positivkontrolle wurden Reagenzien zur Bearbeitung des Tyrosinase (Tyr)-Locus ^9,16 in die Ergänzungstabelle 1 aufgenommen.

Protocol

Die gesamte Tierpflege und -verwendung während dieses Protokolls entsprach den Richtlinien des Tierschutzgesetzes, dem ILAR-Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren und den Richtlinien der AVMA für Euthanasie und den Richtlinien und Richtlinien und Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of Pennsylvania. Das Tierpflege- und Verwendungsprotokoll wurde von der University of Pennsylvania IACUC für dieses Projekt überprüft und genehmigt. Bitte holen Sie aus Grü…

Representative Results

Diese Methode erzeugt mehr als 100 μg sgRNA (20 μL bei >6.000 ng/L Konzentration) für eine effiziente Cas9/sgRNA-RNP-Assemblierung. Die hier beschriebene routinemäßige Superovulationsmethode produziert typischerweise 10-20 lebensfähige Embryonen pro verstopftem Weibchen. Aufgrund von Handhabungsfehlern und typischen Verlusten, die mit der Manipulation von Embryonen verbunden sind, sind voraussichtlich 80% der Embryonen befruchtet, lebensfähig und in ausgezeichnetem Zustand nach der Elektroporation. Um den Forscher…

Discussion

Hier wird eine einfache und hocheffiziente Maus-Genom-Editing-Technologie vorgestellt. Die Elektroporation kann verwendet werden, um modifizierte Embryonen in 1-2 Wochen zu erzeugen (Abbildung 1) und kann innerhalb von 6 Wochen editierte Mäuse produzieren⁹. Im Vergleich zu zeitgleich entwickelten elektroporationsbasierten Protokollen, die RNPs 7,10,11,12,13,14,15,17,32 liefern, ist die hier beschriebene Methode konzeptionell ähnlich und bietet Wirkungsgr…

Materials

0.1-cm-gap electroporation cuvette	Bio-Rad	cat. no. 1652089	Electroporation
26-G, 1/2-inch needle	BD	cat. no. 305111	Superovulation
3–8-month-old male mice and 3- to 5-week-old female mice	JAX	cat. no. 000664	Superovulation
35-mm Tissue culture dish	Greiner Bio-One,	cat. no. 627-160	Embryo Culture
60-mm Tissue culture dish	Greiner Bio-One,	cat. no. 628-160	Embryo Processing
6x loading dye	Thermo Fisher Scientific	cat. no. R0611	sgRNA Synthesis and Genotyping
Acidic Tyrode's (AT) solution, embryo culture grade	Sigma-Aldrich,	cat. no. T1788	Embryo Processing
BSA, embryo culture grade	Sigma-Aldrich	cat. no. A3311	Embryo Processing and Culture
Cas9 protein	Alt-R S.p. Cas9 nuclease 3NLS	cat. no. 1074181	Electroporation
DNase I, RNase-free	New England BioLabs,	cat. no. M0303	sgRNA Synthesis
DPBS(calcium and magnesium free)	Gibco	cat. no. 14190-144	Embryo Processing
EcoRI	NEB	cat. no. R3101S	Genotyping
EDTA, anhydrous	Sigma-Aldrich	cat. no. EDS-100G	RNP Buffer
Ethanol	Koptec	cat. no. V1016	sgRNA Synthesis
Gelatin (powder) type B, laboratory grade	Fisher,	cat. no. G7-500	Lysis Buffer
Glycerol, molecular-biology grade	Fisher	cat. no. BP229	RNP Buffer
Taq Polymerase	Promega	cat. no. M712	Genotyping
HEPES, cell culture grade	Sigma-Aldrich	cat. no. H4034	RNP Buffer
HinfI (10,000 U/mL)	NEB	cat. no. R0155S	Genotyping
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit	New England BioLabs,	cat. no. E2040	sgRNA Synthesis
Human chorion gonadotropin, lyophilized (hCG)	Millipore	cat. no. 230734	Superovulation
Hyaluronidase/M2	Millipore	cat. no. MR-051-F	Embryo Processing
KSOMaa Evolve medium (potassium-supplemented simplex-optimized medium plus amino acids)	Zenith Biotech	cat. no. ZEKS-050	Embryo Culture
LE agarose, analytical grade	BioExpress	cat. no. E-3120-500	sgRNA Synthesis and Genotyping
M2 medium	Zenith Biotech	cat. no. ZFM2-050	Embryo Processing
Magnesium chloride, anhydrous (MgCl2)	Sigma-Aldrich	cat. no. M8266	RNP and Lysis Buffer
Mineral Oil	Millipore	cat. no. ES-005C	Embryo Culture
Nonidet P-40,substitute (NP-40)	Sigma-Aldrich	cat. no. 74385	Lysis Buffer
Nuclease-free water, molecular-biology grade	Ambion	cat. no. AM9937	sgRNA Synthesis and Genotyping
Oligos for sgRNA synthesis, donor oligo and PCR primers for genotyping	Integrated DNA Technologies	custom orders	sgRNA Design
Reduced serum medium	Thermo Fisher Scientific	cat. no. 31985062	Embryo Culture
High-fidelity DNA polymerase	New England BioLabs,	cat. no. M0530	sgRNA Synthesis
Potassium chloridemolecular-biology grade (KCl)	Sigma-Aldrich	cat. no. P9333	RNP and Lysis Buffer
Pregnant mare serum gonadotropin lyophilizd ((PMSG)	ProspecBio	cat. no. HOR-272	Superovulation
Proteinase K, molecular-biology grade	Fisher	cat. no. BP1700-100	Lysis Buffer
RNase-free 1.5-mL microcentrifuge tube	VWR	cat. no. 20170-333	sgRNA Synthesis and Genotyping
RNase-free eight-well PCR strip tubes	VWR	cat. no. 82006-606	sgRNA Synthesis and Genotyping
Magnetic purification beads	GE Healthcare	cat. no. 65152105050250	sgRNA Synthesis
Tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP)	Sigma-Aldrich	cat. no. C4706	RNP Buffer
Tris-HCl solution, pH 8.5 molecular-biology grade	Teknova	cat. no. T1085	Lysis Buffer
Tween 20 molecular-biology grade	Sigma-Aldrich	cat. no. P7949-500	Lysis Buffer