이 프로토콜은 결과적인 신경 염증 반응과 신경 독성을 연구하기 위해 제브라 피쉬 애벌레 모델에서 뇌실 영역에 지질 다당류를 미세 주입하는 것을 보여줍니다.
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이 논문에서
요약
초록
신경 염증은 신경 퇴행성 질환을 포함한 다양한 신경 장애의 핵심 요소입니다. 따라서 신경 퇴행에서 신경 염증의 역할을 이해하기 위해 대체 생체 내 신경 염증 모델을 연구하고 개발하는 것이 큰 관심입니다. 이 연구에서는 면역 반응과 신경 독성을 유도하기 위해 지질 다당류 (LPS)의 심실 미세 주입에 의해 매개되는 신경 염증의 유충 제브라 피쉬 모델이 개발되고 검증되었습니다. 트랜스제닉 제브라피쉬 라인 elavl3:mCherry, ETvmat2:GFP 및 mpo:EGFP는 형광 강도 분석과 통합된 형광 라이브 이미징에 의한 뇌 뉴런 생존력의 실시간 정량화에 사용되었습니다. 제브라 피쉬 유충의 운동 행동은 비디오 추적 레코더를 사용하여 자동으로 기록되었습니다. 유충 제브라피쉬 머리에서 LPS 유도 면역 반응을 평가하기 위해 산화질소(NO)의 함량 및 인터루킨-6(IL-6), 인터루킨-1β(IL-1β) 및 인간 종양 괴사 인자 α(TNF-α)를 포함한 염증성 사이토카인의 mRNA 발현 수준을 조사했습니다. LPS의 뇌실 주사 후 24 시간에 제브라 피쉬 유충에서 뉴런 손실과 운동 결핍이 관찰되었습니다. 또한, LPS 유도 신경염증은 수정 후 6일(dpf) 제브라피쉬 유충의 머리에서 NO 방출 및 IL-6, IL-1β 및 TNF-α의 mRNA 발현을 증가시키고, 제브라피쉬 뇌에서 호중구의 동원을 초래하였다. 이 연구에서는 5dpf에서 2.5-5mg/mL의 농도로 LPS를 제브라피쉬에 주사하는 것이 이 약리학적 신경염증 분석의 최적 조건으로 결정되었습니다. 이 프로토콜은 제브라피쉬 유충에서 LPS 매개 신경염증 및 신경독성을 유도하기 위해 LPS의 뇌실 미세 주입을 위한 새롭고 빠르고 효율적인 방법론을 제시하며, 이는 신경염증 연구에 유용하며 고처리량 생체 내 약물 스크리닝 분석으로도 사용될 수 있습니다.
서론
신경 염증은 중추 신경계 (CNS)의 여러 신경 퇴행성 질환의 발병 기전에 관여하는 중요한 항 신경 인성 인자로 설명되었습니다 1. 병리학 적 모욕 후, 신경 염증은 신경 발생의 억제 및 신경 세포 사멸의 유도를 포함하여 다양한 부작용을 초래할 수 있습니다 2,3. 염증 유도에 대한 반응의 기초가되는 과정에서 여러 염증성 사이토 카인 (예 : TNF-α, IL-1β 및 IL-6)이 세포 외 공간으로 분비되어 뉴런 사멸 및 신경 발생억제에 중요한 구성 요소로 작용합니다 4,5,6.
염증 매개체 (예 : IL-1β, L- 아르기닌 및 내 독소)를 뇌에 미세 주입하면 신경 세포 감소 및 신경 염증 7,8,9가 발생할 수 있습니다. 그람 음성 박테리아의 세포벽에 존재하는 병....
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프로토콜
AB 야생형 제브라피쉬 및 형질전환 제브라피쉬 라인 elavl3:mCherry, ETvmat2:GFP, 및 mpo:EGFP는 중국의학연구소(ICMS)로부터 입수하였다. 동물 실험에 대한 윤리적 승인 (UMARE-030-2017)은 마카오 대학의 동물 연구 윤리위원회에서 부여되었으며 프로토콜은 기관 동물 관리 지침을 따릅니다.
1. 제브라 피쉬 배아와 애벌레 축산
- 이전에 보고된 대로 자연 쌍 교배에 의해 제브라피쉬 배아(교배당 200-300개의 배아)를 생성합니다28.
- ddH2O에 NaCl 34.8g, KCl 1.6g, CaCl2·2H2O 5.8g,MgCl2·6H2O9.78g을 용해시켜 계란물(E3) 중간 스톡(60×)을 최종 부피 2L로준비하고 NaOH 및 HCl을 사용하여 pH를 7.2로 조정합니다. E3 배지(1×)의 작업 농도를 준비하려면 스톡을ddH2O에 60배 희석하고 사용하지 않을 때는 28.5°C에서 보관하십시오.
- 플라스틱 이송 피펫을 사용하여 제브라 피쉬 배아를 E3 배지가 들어있는 접시....
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결과
여기에 설명 된 워크 플로는 제브라 피쉬 유충에서 LPS 매개 신경 염증 및 신경 독성을 유도하기위한 새롭고 빠르고 효율적인 방법론을 제시합니다. 이 설명된 프로토콜에서 5개의 dpf 제브라피쉬에 LPS(그림 1)를 미세 주입기를 사용하여 뇌실에 주입했습니다(그림 2A-C). 뇌실 부위로의 성공적인 주사는 1% Evans blue 염색을 사용하여 확인되었습니다(그림 2D). 제브라 피쉬 머리는 주사기 (그림 2E)를 사용하여 눈과 몸에서 분리되어 제브라 피쉬 몸에서 염증성 사이토 카인 발현과 산화 질소 방출이 뇌의 신경 염증 및 신경 독성 측정에 미치는 영향을 배제했습니다.
동일한 부피의 PBS (LPS와 동.......
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토론
역학 및 실험 데이터의 증가는 만성 세균 및 바이러스 감염을 신경 퇴행성 질환의 가능한 위험 인자로 암시합니다36. 감염은 염증 과정의 활성화와 숙주 면역 반응을 유발합니다37. 반응이 방어 메카니즘으로서 작용하더라도, 과활성화된 염증은 신경 발생에 해롭고, 염증 환경은 신생아 뉴런(38)의 생존을 허용하지 않는다. 결과적으로, 숙주 뉴런 기능 및 생존력에 손상을 일으킨다. 연구에 따르면 염증은 신경 퇴행의 병태 생리학에 중요한 역할을합니다39.
자주 연구되는 병원성 내 독소로서 LPS는 신경 발생 및 신경 퇴행의 억제와 관련이 있습니다. 염증 과정의 LPS 활성화는 부분적으로 NO, TNF-α, IL-6 및 IL-1β40의 생성을 통해 신경 발생을 상당히 손상시킵니다.......
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공개 사항
저자는 경쟁하는 재정적 이익이 없다고 선언합니다.
감사의 글
이 연구는 마카오 SAR의 과학 기술 개발 기금 (FDCT)의 보조금으로 지원되었습니다 (참조 번호. FDCT0058/2019/A1 및 0016/2019/AKP), 마카오 대학교 연구 위원회(MYRG2020-00183-ICMS 및 CPG2022-00023-ICMS) 및 중국 국립 자연 과학 재단(No. 81803398).
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Agarose | Sigma-Aldrich | A6361 | |
| Agarose, 저겔화 온도 | Sigma-Aldrich | A9414 | |
| Drummond Nanoject III 프로그래밍 가능한 나노리터 인젝터 | Drummond Scientific | 3-000-207 | |
| 형광 실체 현미경 | Leica | M205 FA | |
| GraphPad 프리즘 소프트웨어 | GraphPad 소프트웨어 | Ver. 7.04 | |
| 대장균 O111:B4 | Sigma-Aldrich | L3024 | |
| 수동 미세 조작기 | World Precision Instruments | M3301 | |
| 미네랄 오일 | Sigma-Aldrich | M5904 | |
| Mx3005P qPCR 시스템 | Agilent Technologies | Mx3005P | |
| Nanovue plus 분광 광도계 | Biochrom | 80-2140-46 | |
| 아질산염 농도 분석 키트 | Beyotime Biotechnology | S0021M | |
| 인산염 완충 식염수 | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| 프로그래밍 가능한 수평 피펫 풀러 | World Precision Instruments | PMP-102 | |
| PTU (N-Phenylthiourea) | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| 랜덤 프라이머 | Takara | 3802 | |
| SuperScript II 역전사 효소 | Invitrogen | 18064014 | |
| SYBR Premix Ex Taq II 키트 | 정확한 생물학 | AG11701 | |
| 3세대 Tgrinder | Tiangen | OSE-Y30 | |
| 필라멘트가 있는 얇은 벽 유리 모세관(4인치), OD 1.5mm | World Precision Instruments | TW150F-4 | |
| 트리카인(3-아미노벤조산, 에틸에스테르), | 시그마-알드리치 | A-5040 | |
| TRNzol, 만능 시약 | , Tiangen | DP424 | |
| 제브라피시 추적 상자 | , ViewPoint Behavior Technology |
참고문헌
- Xanthos, D. N., Sandkuhler, J. Neurogenic neuroinflammation: inflammatory CNS reactions in response to neuronal activity. Nature Reviews Neuroscience. 15 (1), 43-53 (2014).
- Fan, L. W., Pang, Y.
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재인쇄 및 허가
