Avaliação da Saúde Mitocondrial em Fibroblastos Associados ao Câncer Isolados de Esferoides de Tumores Pulmonares Multicelulares 3D
Summary
Esferoides tumorais 3D multicelulares foram preparados com células de adenocarcinoma pulmonar, fibroblastos e monócitos, seguidos pelo isolamento de fibroblastos associados ao câncer (CAFs) desses esferoides. CAFs isolados foram comparados com fibroblastos normais para avaliar a saúde mitocondrial estudando o potencial transmembranar mitocondrial, espécies reativas de oxigênio e atividades enzimáticas.
Abstract
Os fibroblastos associados ao câncer (CAFs) estão entre as células estromais mais abundantes presentes no microambiente tumoral, facilitando o crescimento e a progressão do tumor. A complexidade dentro do microambiente tumoral, incluindo secretoma tumoral, inflamação de baixo grau, hipóxia e desequilíbrio redox, promove a interação heterotípica e permite a transformação de fibroblastos residentes inativos para se tornarem CAFs ativos. Os CAFs distinguem-se metabolicamente dos fibroblastos normais (NFs), pois são mais glicoliticamente ativos, produzem níveis mais altos de espécies reativas de oxigênio (ROS) e superexpressam o exportador de lactato MCT-4, levando à abertura do poro de transição de permeabilidade mitocondrial (MPTP). Aqui um método foi descrito para analisar a saúde mitocondrial de CAFs ativados isolados dos esferoides tumorais 3D multicelulares compostos por células de adenocarcinoma pulmonar humano (A549), monócitos humanos (THP-1) e células de fibroblastos pulmonares humanos (MRC5). Os esferoides tumorais foram desintegrados em diferentes intervalos de tempo e, por meio da triagem celular ativada por magnetismo, os CAFs foram isolados. O potencial de membrana mitocondrial dos CAFs foi avaliado por meio do corante JC-1, da produção de ROS pela coloração de diacetato de 2′,7′-diclorodihidrofluoresceína (DCFDA) e da atividade enzimática nos CAFs isolados. A análise da saúde mitocondrial de CAFs isolados fornece uma melhor compreensão do efeito Warburg reverso e também pode ser aplicada para estudar as consequências das alterações mitocondriais do CAF, como fluxos metabólicos e os mecanismos regulatórios correspondentes na heterogeneidade do câncer de pulmão. Assim, o presente estudo defende a compreensão das interações tumor-estroma na saúde mitocondrial. Ele forneceria uma plataforma para verificar os candidatos a medicamentos específicos mitocondriais quanto às suas eficácias contra CAFs como terapêuticas potenciais no microambiente tumoral, evitando assim o envolvimento do CAF na progressão do câncer de pulmão.
Introduction
Os tumores sólidos são compostos por populações celulares heterogêneas que são guiadas pelo microambiente tumoral (EMT), no entanto, a origem da maioria das células ainda não foi descoberta. Principalmente células estromais e imunes (fibroblastos, células endoteliais, monócitos, macrófagos, células dendríticas, células B, células T e seus subconjuntos) refletem a heterogeneidade tumoral em câncer de pulmão, mama, renal e outros cânceres sólidos 1,2,3. Compreender a origem de cada subtipo e seu potencial de transdiferenciação é de extrema necessidade para o desenvolvimento de terapias avançadas contra esses tipos de câncer. A análise dessa população celular diversificada em biópsias humanas apresenta-se com diversos desafios devido ao tipo de tumor, localização, estágio, limitação da quantidade de amostra e variabilidades específicas do paciente4. Assim, é necessário um modelo experimental, que não seja apenas confiável, mas também possa simular a condição tumoral in vivo, mostrando-se ideal para o estudo do crosstalk tumor-estroma e seu envolvimento na fisiopatologia da doença.
As culturas tridimensionais (3D) de tumores multicelulares esferoides (MCTS) são um sistema modelo in vitro vantajoso de tumores devido à sua semelhança com contrapartes naturais. O MCTS pode replicar melhor aspectos de tumores sólidos do que os modelos de cultura de células 2D, incluindo sua arquitetura espacial, respostas fisiológicas, liberação de mediadores solúveis, padrões de expressão gênica e mecanismos de resistência a medicamentos. Além disso, uma das principais vantagens do MCTS é que ele pode ser usado para estudar a heterogeneidade tumoral e o microambiente tumoral (EMT). O método hanging-drop é a ferramenta mais comumente empregada para desenvolver e analisar o MCTS5. Neste método, as diferentes células com meios são suspensas na forma de gotículas, o que permite o seu crescimento de forma agregada 3D coerente e é de fácil acesso para exame. A técnica é simples; não requer muitas células e elimina a necessidade de um substrato especializado como a agarose para o desenvolvimento esferoide6. Uma vantagem adicional deste método reside na reprodutibilidade de sua técnica. Além disso, esse método também tem sido utilizado para co-cultivar populações de células mistas, como células endoteliais e células tumorais, para simular a angiogênese tumoral precoce7.
Neste estudo, esferoides de tumores pulmonares 3D multicelulares foram preparados com células de adenocarcinoma pulmonar, fibroblastos e monócitos usando o método de gota suspensa que imita o microambiente do tumor pulmonar. Em seguida, a população de fibroblastos associados ao câncer (CAF) foi isolada para investigar a saúde mitocondrial. A ideia principal por trás do desenvolvimento desses esferoides é isolar os CAFs, pois o crosstalk entre as células em esferoides poderia transformar os fibroblastos em um estado CAF ativado semelhante a um miofibroblasto. Em segundo lugar, este estudo também pode descrever como a produção aberrante de ERO e a disfunção mitocondrial impulsionam os fibroblastos normais em direção ao fenótipo CAF mais agressivo. Verificou-se que fibroblastos montados dentro de esferoides tumorais ganharam características miofibroblásticas com aumento da atividade das EROs e indução da expressão gênica metabólica. Este protocolo destaca a importância do microambiente tumoral na ativação da CAF e pode ser um excelente modelo para geração in vitro e estudo das características fenotípicas da CAF.
Protocol
Representative Results
Discussion
O presente estudo apresenta o desenvolvimento de esferoides tumorais multicelulares compreendendo células tumorais, população de células estromais (isto é, fibroblastos) e população de células imunes (ou seja, monócitos) usando um método modificado de gota suspensa. Fibroblastos e monócitos/macrófagos estão entre as populações mais significativas que constituem o microambiente tumoral (EMT), e sua presença está frequentemente ligada ao mau prognóstico do paciente16. Quando presen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo SERB-Women Excellence Award Project, Índia (SB/WEA-02/2017) e pelo SERB-Early Career Research Award Project, Índia (ECR/2017/000892) para a DP. Os autores, LA e SR reconhecem o IIT Ropar e o MHRD por suas bolsas de pesquisa. MK reconhece o ICMR por sua bolsa de pesquisa.
Materials
| Antibodies | |||
| APC anti-human α-SMA | R&D systems | Cat# IC1420A | |
| Anti-fibroblast microbeads | Miltenyi Biotec | Cat# 130-050-601 | |
| Cell lines | |||
| A549 lung adenocarcinoma cells | NCCS Pune | – | |
| MRC-5 fetal lung fibroblasts | ATCC | CCL-171 | |
| THP-1 Human monocytes | NCCS Pune | – | |
| Chemicals | |||
| BSA | Himedia | Cat# 9048-46-8 | |
| 2,6-dichloroindophenol (DCPIP) | SRL | Cat# 55287 | |
| Calcein-AM | Thermo Fisher Scientific | Cat# C3099 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | Cat# D1306 | |
| DCFDA | Sigma | Cat# D6883 | |
| DMEM | Gibco | Cat# 11995073 | |
| DPBS | Gibco | Cat# 14190-144 | |
| EDTA | Thermo fisher scientific | Cat# 17892 | |
| EGTA | SRL | Cat# 62858 | |
| EZcoun Lactate Dehydrogenase Cell Assay Kit | HiMedia | Cat# CCK036 | |
| FBS | Gibco | Cat# 10082147 | |
| Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) | Thermo Fisher Scientific | Cat# 87786 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | Cat# 15630080 | |
| Horse heart Cytochrome c | SRL | Cat# 81551 | |
| Image-iT Red hypoxia reagent | Thermo Fisher Scientific | Cat# H10498 | |
| JC-1 Dye | Thermo Fisher Scientific | Cat# T3168 | |
| KCl | Merck | Cat# P9541 | |
| MgCl2 | Merck | Cat# M8266 | |
| MOPS | Thermo Fisher Scientific | Cat# 69824 | |
| Nacl | Sigma-Aldrich | Cat# S9888 | |
| NADH MB Grade | SRL | Cat# 54941 | |
| NP-40 | Thermo Fisher Scientific | Cat# 85124 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | Cat# 15140122 | |
| Phenazine methosulfate (PMS) | SRL | Cat# 55782 | |
| Propidium iodide | Thermo fisher scientific | Cat# P1304MP | |
| RPMI 1640 | Gibco | Cat# 11875093 | |
| Single Cell Lysis Kit | Thermo Fisher Scientific | Cat# 4458235 | |
| Sodium ascorbate | Merck | Cat# A7631 | |
| Sodium cyanide | Sigma | Cat# 205222 | |
| Sodium Deoxycholate | Thermo Fisher Scientific | Cat# 89904 | |
| Sodium dodecyl sulphate | Sigma-Aldrich | Cat# L3771 | |
| Sodium succinate hexahydrate | SRL | Cat# 36313 | |
| Sucrose | Sigma | Cat# S0389 | |
| SuperScript VILO cDNA synthesis kit | Thermo Fisher Scientific | Cat# 11754-050 | |
| Triton X-100 | Sigma | Cat# T8787 | |
| Trypsin 0.25% EDTA | Gibco | Cat# 25200072 | |
| Universal SYBR Green Supermix | BIO-RAD | Cat# 172-5124 | |
| Plasticware | |||
| MACS LS Columns | Miltenyi Biotec | Cat# 130-042-401 | |
| Equipment | |||
| Countess II FL Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | Cat# AMQAF1000 | |
| EVOS XL core imaging system | Thermo Fisher Scientific | Serial Number F0518-1727-0191 | |
| LAS X software | Leica Microsystems | ||
| Leica fluorescent inverted microscope | s | DMi8 automated S/N 424150) | |
| Midi MACS separator | Miltenyi Biotec | Cat# 130-042-302 |
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