Automatisk bildbehandling för att bestämma gemenskapens storleksstruktur för flodmakroinvertebrater
Summary
Artikeln är baserad på skapandet av ett anpassat protokoll för att skanna, upptäcka, sortera och identifiera digitaliserade objekt som motsvarar bentiska flodmakroinvertebrater med hjälp av ett halvautomatiskt avbildningsförfarande. Denna procedur möjliggör förvärv av de individuella storleksfördelningarna och storleksmåtten för ett makroinvertebratsamhälle på cirka 1 timme.
Abstract
Kroppsstorlek är ett viktigt funktionellt drag som kan användas som en bioindikator för att bedöma effekterna av störningar i naturliga samhällen. Gemenskapens storleksstruktur svarar på biotiska och abiotiska gradienter, inklusive antropogena störningar mellan taxa och ekosystem. Den manuella mätningen av småkroppiga organismer som bentiska makroinvertebrater (t.ex. >500 μm till några centimeter långa) är dock tidskrävande. För att påskynda uppskattningen av gemenskapens storleksstruktur utvecklade vi här ett protokoll för att halvautomatiskt mäta den individuella kroppsstorleken hos bevarade flodmakroinvertebrater, som är en av de vanligaste bioindikatorerna för att bedöma den ekologiska statusen för sötvattenekosystem. Detta protokoll är anpassat från en befintlig metod som utvecklats för att skanna marina mesozooplankton med ett skanningssystem utformat för vattenprover. Protokollet består av tre huvudsteg: (1) skanning av delprover (fina och grova provstorleksfraktioner) av flodmakroinvertebrater och bearbetning av de digitaliserade bilderna för att individualisera varje upptäckt objekt i varje bild; (2) skapa, utvärdera och validera en inlärningsuppsättning genom artificiell intelligens för att halvautomatiskt separera de enskilda bilderna av makroinvertebrater från detritus och artefakter i de skannade proverna; och (3) skildrar storleksstrukturen hos makroinvertebratsamhällena. Förutom protokollet inkluderar detta arbete kalibreringsresultaten och räknar upp flera utmaningar och rekommendationer för att anpassa proceduren till makroinvertebratprover och att överväga för ytterligare förbättringar. Sammantaget stöder resultaten användningen av det presenterade skanningssystemet för automatisk kroppsstorleksmätning av flodmakroinvertebrater och tyder på att skildringen av deras storleksspektrum är ett värdefullt verktyg för snabb biobedömning av sötvattenekosystem.
Introduction
Bentiska makroinvertebrater används i stor utsträckning som bioindikatorer för att bestämma vattenförekomsternas ekologiska status1. De flesta index för att beskriva makroinvertebratsamhällen fokuserar på taxonomiska mätvärden. Nya biobedömningsverktyg som integrerar kroppsstorlek uppmuntras dock att ge ett alternativt eller kompletterande perspektiv till taxonomiska metoder 2,3.
Kroppsstorlek anses vara en metatrait som är relaterad till andra viktiga egenskaper som ämnesomsättning, tillväxt, andning och rörelse4. Dessutom kan kroppsstorlek bestämma trofisk position och interaktioner5. Förhållandet mellan individuell kroppsstorlek och den normaliserade biomassan (eller överflödet) efter storleksklass i ett samhälle definieras som storleksspektrumet6 och följer det allmänna mönstret för en linjär minskning av normaliserad biomassa när individuell storlek ökar på en logaritmisk skala7. Lutningen av detta linjära förhållande har studerats omfattande teoretiskt, och empiriska studier över ekosystem har använt det som en ekologisk indikator på samhällsstorleksstrukturen4. En annan syntetisk indikator på samhällsstorleksstruktur som framgångsrikt har använts i studier av biologisk mångfald-ekosystemfunktion är samhällsstorleksdiversitet, som representeras som Shannon-indexet för storleksklasserna i storleksspektrumet eller dess analog, som beräknas baserat på de individuella storleksfördelningarna8.
I sötvattensekosystem används storleksstrukturen för olika faunagrupper som en ataxisk indikator för att bedöma biotiska samhällens svar på miljögradienter 9,10,11 och på antropogena störningar 12,13,14,15,16. Makroinvertebrater är inget undantag, och deras storleksstruktur svarar också på miljöförändringar17,18 och antropogena störningar, såsom gruvdrift 19, markanvändning 20 eller kväve (N) och fosfor (P) anrikning20,21,22. Att mäta hundratals individer för att beskriva samhällets storleksstruktur är dock en tråkig och tidskrävande uppgift som ofta undviks som en rutinmätning i laboratorier på grund av tidsbrist. Således har flera halvautomatiska eller automatiska avbildningsmetoder för att klassificera och mäta prover utvecklats23,24,25,26. De flesta av dessa metoder är dock inriktade på taxonomisk klassificering mer än på organismernas individuella storlek och är inte redo att användas för alla typer av makroinvertebrater. Inom marin planktonekologi har ett skanningsbildanalyssystem använts i stor utsträckning för att bestämma storleken och taxonomiska sammansättningen av djurplanktonsamhällen 27,28,29,30,31. Detta instrument finns i flera marina institut över hela världen, och det används för att skanna bevarade djurplanktonprover för att få högupplösta digitala bilder av hela provet. Detta protokoll anpassar användningen av detta instrument för att uppskatta makroinvertebratsamhällets storleksspektrum i floder på ett snabbt automatiskt sätt utan att investera i att skapa en ny enhet.
Protokollet består av att skanna ett prov och bearbeta hela bilden för att automatiskt få enstaka bilder (dvs. vinjetter) av objekten i provet. Flera mått på form, storlek och grånivåfunktioner kännetecknar varje objekt och möjliggör automatisk klassificering av objekten i kategorier, som sedan valideras av en expert. Den individuella storleken på varje organism beräknas med hjälp av den ellipsoidala biovolymen (mm3), som härrör från organismens yta mätt i pixlar. Detta möjliggör att provets storleksspektrum erhålls på ett snabbt sätt. Så vitt vi vet har detta skanningsavbildningssystem endast använts för att bearbeta mesozooplanktonprover, men enheten kan potentiellt möjliggöra arbete med sötvattensbentiska makroinvertebrater.
Det övergripande målet med denna studie är därför att introducera en metod för att snabbt erhålla den individuella storleken på bevarade flodmakroinvertebrater genom att anpassa ett befintligt protokoll som tidigare använts med marina mesozooplankton 27,32,33. Proceduren består av att använda ett halvautomatiskt tillvägagångssätt som fungerar med en skanningsenhet för att skanna vattenprover och tre öppna program för att bearbeta de skannade bilderna. Ett anpassat protokoll för att skanna, upptäcka och identifiera digitaliserade flodmakroinvertebrater för att automatiskt förvärva gemenskapens storleksstruktur och relaterade storleksmått presenteras häri. Bedömningen av förfarandet och riktlinjerna för att förbättra effektiviteten presenteras också baserat på 42 skannade bilder av prover av makroinvertebrater från floder som samlats in från tre bassänger på den nordöstra (NE) iberiska halvön (Ter, Segre-Ebre och Besòs).
Proverna samlades in vid 100 m flodsträckor enligt protokollet för fältprovtagning och laboratorieanalys av bentiska flodmakroinvertebrater i vadbara floder från den spanska regeringen34. Proverna samlades in med en surber sampler (ram: 0,3 m x 0,3 m, mesh: 250 μm) efter en multihabitatundersökning. I laboratoriet rengjordes proverna och siktades genom en maska på 5 mm och 500 μm för att erhålla två delprover: ett grovt delprov (5 mm maska) och ett fint delprov (500 μm maska), som förvarades i separata injektionsflaskor och konserverades i 70 % etanol. Genom att separera provet i två storleksfraktioner kan man bättre uppskatta gemenskapens storleksstruktur, eftersom stora organismer är sällsyntare och färre än de små organismerna. Annars har det skannade provet en partisk representation av den stora storleksfraktionen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Anpassningen av den metod som beskrivs av Gorsky et al. 2010 för flodmakroinvertebrater möjliggör hög klassificeringsnoggrannhet vid uppskattning av gemenskapens storleksstruktur hos sötvattensmakroinvertebrater. Resultaten tyder på att protokollet kan minska tiden för att uppskatta den individuella storleksstrukturen i ett prov till cirka 1 timme. Således är det föreslagna protokollet avsett att främja rutinmässig användning av makroinvertebraters storleksspektra som en snabb och integrerande bioindikator f…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av det spanska ministeriet för vetenskap, innovation och universitet (bidragsnummer RTI2018-095363-B-I00). Vi tackar CERM-UVic-UCC-medlemmarna Èlia Bretxa, Anna Costarrosa, Laia Jiménez, María Isabel González, Marta Jutglar, Francesc Llach och Núria Sellarès för deras arbete inom makroinvertebratfältprovtagning och laboratoriesortering och David Albesa för att ha samarbetat i provskanningen. Vi tackar slutligen Josep Maria Gili och Institut de Ciències del Mar (ICM-CSIC) för användningen av laboratoriefaciliteterna och skannerenheten.
Materials
| Beaker | Labbox | Other containers could be used | |
| Dionized water | Icopresa | 8420239600123 | To dilute the ethanol |
| Funnel | Vitlab | 41094 | |
| Glass vials 8 ml | Labbox | SVSN-C10-195 | 1 vial/subsample |
| ImageJ Software | Free access | Version 4.41o/ Image processing software | |
| Large frame | Hydroptic | Provided by ZooScan | 24.5 cm x 15.8 cm |
| Monalcol 96 (Ethanol 96) | Montplet | 1050JE001 | |
| Plankton Identifier Software | Free access | Version 1.2.6/ Automatic identification software | |
| Sieve | Cisa | 26852.2 | Nominal aperture 500µ and nominal aperture 0,5 cm |
| Tweezers | Bondline | B5SA | Stainless, anti-magnetic, anti-acid |
| VueScan 9 x 64 (9.5.09) Software | Hydroptic | Version 9.0.51/ Sacn software | |
| Wooden needle | Any plastic or wood needle can be used | ||
| Zooprocess Software | Free access | Version 7.14/Image processing software | |
| ZooScan | Hydroptic | 54 | Version III/ Scanner |
References
- Birk, S., et al. Three hundred ways to assess Europe’s surface waters: An almost complete overview of biological methods to implement the Water Framework Directive. Ecological Indicators. 18, 31-41 (2012).
- Basset, A., Sangiorgio, F., Pinna, M. Monitoring with benthic macroinvertebrates: advantages and disadvantages of body size descriptors. Aquatic Conservation: Marine and Freshwater Ecosystems. 14, S43-S58 (2004).
- Reyjol, Y., et al. Assessing the ecological status in the context of the European Water Framework Directive: Where do we go now. Science of the Total Environment. 497-498, 332-344 (2014).
- Brown, J. H., Gillooly, J. F., Allen, A. P., Savage, V. M., West, G. B. Toward a metabolic theory of ecology. Ecology. 85 (7), 1771-1789 (2004).
- Woodward, G., et al. Body size in ecological networks. Trends in Ecology & Evolution. 20 (7), 402-409 (2005).
- Sprules, W. G., Barth, L. E. Surfing the biomass size spectrum: Some remarks on history, theory, and application. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 73 (4), 477-495 (2016).
- White, E. P., Ernest, S. K. M., Kerkhoff, A. J., Enquist, B. J. Relationships between body size and abundance in ecology. Trends in Ecology & Evolution. 22 (6), 323-330 (2007).
- Quintana, X. D., et al. A nonparametric method for the measurement of size diversity with emphasis on data standardization. Limnology and Oceanography – Methods. 6 (1), 75-86 (2008).
- Blanchard, J. L., Heneghan, R. F., Everett, J. D., Trebilco, R., Richardson, A. J. From bacteria to whales: Using functional size spectra to model marine ecosystems. Trends in Ecology & Evolution. 32 (3), 174-186 (2017).
- Petchey, O. L., Belgrano, A. Body-size distributions and size-spectra: Universal indicators of ecological status. Biology Letters. 6 (4), 434-437 (2010).
- Emmrich, M., et al. Geographical patterns in the body-size structure of European lake fish assemblages along abiotic and biotic gradients. Journal of Biogeography. 41 (12), 2221-2233 (2014).
- Arranz, I., Brucet, S., Bartrons, M., García-Comas, C., Benejam, L. Fish size spectra are affected by nutrient concentration and relative abundance of non-native species across streams on the NE Iberian Peninsula. Science of the Total Environment. 795, 148792 (2021).
- Vila-Martínez, N., Caiola, N., Ibáñez, C., Benejam, L. l., Brucet, S. Normalized abundance spectra of the fish community reflect hydropeaking on a Mediterranean large river. Ecological Indicators. 97, 280-289 (2019).
- Benejam, L. l., Tobes, I., Brucet, S., Miranda, R. Size spectra and other size-related variables of river fish communities: systematic changes along the altitudinal gradient on pristine Andean streams. Ecological Indicators. 90, 366-378 (2018).
- Sutton, I. A., Jones, N. E. Measures of fish community size structure as indicators for stream monitoring programs. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 77 (5), 824-835 (2019).
- Murry, B. A., Farrell, J. M. Resistance of the size structure of the fish community to ecological perturbations in a large river ecosystem. Freshwater Biology. 59, 155-167 (2014).
- Townsend, C. R., Thompson, R. M., Hildrew, A. G., Raffaelli, D. G., Edmonds-Brown, R. Body size in streams: Macroinvertebrate community size composition along natural and human-induced environmental gradients. In Body Size: The Structure and Function of Aquatic Ecosystems. , (2007).
- Gjoni, V., et al. Patterns of functional diversity of macroinvertebrates across three aquatic ecosystem types, NE Mediterranean. Mediterranean Marine Science. 20 (4), 703-717 (2019).
- Pomeranz, J. P. F., Warburton, H. J., Harding, J. S. Anthropogenic mining alters macroinvertebrate size spectra in streams. Freshwater Biology. 64 (1), 81-92 (2019).
- García-Girón, J., et al. Anthropogenic land-use impacts on the size structure of macroinvertebrate assemblages are jointly modulated by local conditions and spatial processes. Environmental Research. 204, 112055 (2022).
- Demi, L. M., Benstead, J. P., Rosemond, A. D., Maerz, J. C. Experimental N and P additions alter stream macroinvertebrate community composition via taxon-level responses to shifts in detrital resource stoichiometry. Functional Ecology. 33 (5), 855-867 (2019).
- Basset, A., et al. A benthic macroinvertebrate size spectra index for implementing the Water Framework Directive in coastal lagoons in Mediterranean and Black Sea ecoregions. Ecological Indicators. 12 (1), 72-83 (2012).
- Ärje, J., et al. Automatic image-based identification and biomass estimation of invertebrates. Methods in Ecology and Evolution. 11 (8), 922-931 (2020).
- Raitoharju, J., et al. Benchmark database for fine-grained image classification of benthic macroinvertebrates. Image and Vision Computing. 78, 73-83 (2018).
- Lytle, D. A., et al. Automated processing and identification of benthic invertebrate samples. Journal of the North American Benthological Society. 29 (3), 867-874 (2010).
- Serna, J. P., Fernández, D. S., Vélez, F. J., Aguirre, N. J. An image processing method for recognition of four aquatic macroinvertebrates genera in freshwater environments in the Andean region of Colombia. Environmental Monitoring and Assessment. 192, 617 (2020).
- Gorsky, G., et al. Digital zooplankton image analysis using the ZooScan integrated system. Journal of Plankton Research. 32 (3), 285-303 (2010).
- Marcolin, C. R., Schultes, S., Jackson, G. A., Lopes, R. M. Plankton and seston size spectra estimated by the LOPC and ZooScan in the Abrolhos Bank ecosystem (SE Atlantic). Continental Shelf Research. 70, 74-87 (2013).
- Silva, N., Marcolin, C. R., Schwamborn, R. Using image analysis to assess the contributions of plankton and particles to tropical coastal ecosystems. Estuarine, Coast and Shelf Science. 219, 252-261 (2019).
- Vandromme, P., et al. Assessing biases in computing size spectra of automatically classified zooplankton from imaging systems: A case study with the ZooScan integrated system. Methods in Oceanography. 1-2, 3-21 (2012).
- Naito, A., et al. Surface zooplankton size and taxonomic composition in Bowdoin Fjord, north-western Greenland: A comparison of ZooScan, OPC and microscopic analyses. Polar Science. 19, 120-129 (2019).
- . Zooprocess/Plankton Identifier protocol for computer assisted zooplankton sorting Available from: https://manualzz.com/doc/43116355/zooprocess—plankton-identifier-protocol-for (2013)
- Protocolo de muestreo y laboratorio de fauna bentónica de invertebrados en ríos vadeables. CÓDIGO: ML-Rv-I-2013. Ministerio de Agricultura, Alimentación y Medio Ambiente Available from: https://www.miteco.gob.es/es/agua/temas/estado-y-calidad-de-las-aguas/ML-Rv-I-2013_Muestreo%20y%20laboratorio_Fauna%20bent%C3%B3nica%20de%20de%20invertebrado_%20R%C3%Ados%20vadeables_24_05_2013_tcm30-175284.pdf (2013)
- García-Comas, C., et al. Prey size diversity hinders biomass trophic transfer and predator size diversity promotes it in planktonic communities. Proceedings of the Royal Society Biological Sciences. 283 (1824), 20152129 (2016).
- García-Comas, C., et al. Mesozooplankton size structure in response to environmental conditions in the East China Sea: How much does size spectra theory fit empirical data of a dynamic coastal area. Progress in Oceanography. 121, 141-157 (2014).
- Marquina, D., Buczek, M., Ronquist, F., Lukasik, P. The effect of ethanol concentration on the morphological and molecular preservation of insects for biodiversity studies. PeerJ. 9, 10799 (2021).
- Bell, J. L., Hopcroft, R. R. Assessment of ZooImage as a tool for the classification of zooplankton. Journal of Plankton Research. 30 (12), 1351-1367 (2008).
- Colas, F., et al. The ZooCAM, a new in-flow imaging system for fast onboard counting, sizing and classification of fish eggs and metazooplankton. Progress in Oceanography. 166, 54-65 (2018).
- Bachiller, E., Fernandes, J. A., Irigoien, X. Improving semiautomated zooplankton classification using an internal control and different imaging devices. Limnology and Oceanography Methods. 10 (1), 1-9 (2012).
