Kontakt overfølsomhet (CHS) er en murine eksperimentell modell av allergisk kontaktdermatitt (ACD). CHS er basert på sensibilisering med reaktiv hapten ved å male den barberte huden på brystet og magen, med en påfølgende ørehudutfordring med en fortynnet hapten, noe som forårsaker en hevelsesreaksjon som vurderes på forskjellige måter.
Kontakt overfølsomhet (CHS) er en eksperimentell modell av allergisk kontaktdermatitt (ACD) som kan studeres hos mus. Denne studien tar sikte på å presentere en objektiv laboratoriemetode som kan bidra til å studere CHS-reaksjonen hos mus, som kan måles og kvantifiseres ved ulike tester. For å indusere CHS, på dag “0”, ble mus sensibilisert på et tidligere barbert sted ved abdominal hudmaling med hapten 2,4,6-trinitroklorbenzen (TNCB) i en aceton-etanolblanding, mens negative kontrollmus ble humbug sensibilisert med kjøretøyet alene-aceton-etanolblanding. På dag “4” ble øretykkelsen målt med et mikrometer før CHS (utfordring) ble fremkalt ved å male begge ørene med fortynnet TNCB både i test- og kontrollgruppene. Etter 24 timer ble ørehevelsen målt med et mikrometer. CHS er et eksempel på en T-cellemediert immunrespons som forårsaker hevelse i betent vev, med en topp 24 timer etter hudutfordringen med samme hapten. En økning i øreødem korrelert med økt ørevekt, myeloperoksidase (MPO) aktivitet, proinflammatorisk cytokinkonsentrasjon i øreekstraktene, økt fortykkelse av edematøs dermis i histologisk undersøkelse og øre vaskulær permeabilitet. Det var også en økning i konsentrasjonen av TNP-spesifikke IgG1-antistoffer i sera i testgruppen sammenlignet med kontrollmusene. I tillegg kan CHS overføres med CHS-effektorceller oppnådd fra givere som tidligere er sensibilisert med TNCB. CHS-effektorcellene ble administrert intravenøst til naive mottakermus, som senere ble utfordret med samme fortynnede hapten. Ørehevelse ble målt med et mikrometer 24 timer senere.
Allergisk kontaktdermatitt (ACD) er en vanlig hudinflammatorisk sykdom i industrialiserte land forårsaket av en type IV overfølsomhetsreaksjon som følge av eksponering for kjemikalier med lav molekylvekt kalt haptens. Stoffene som forårsaker kontaktsensibilisering hos mennesker inkluderer tungmetallioner (krom, nikkel, jern, kobolt), terpentin, dufter, fargestoffer og konserveringsmidler som finnes i kosmetikk (f.eks. p-fenylendiamin), noen stoffer (f.eks. Neomycin, benzokain), β-laktamantibiotika (dvs. penicillin), kjemikalier produsert av planter (pentadecacatechol, et stoff som finnes i gift eføy), samt hydrokinon brukt i fotografisk industri 1,2 . ACD etiologiske midler er svært høye da over 100 000 kjemikalier brukes i industrien alene, og 2000 nye syntetiseres hvert år. Til nå er det identifisert mer enn 3 700 molekyler som kan være kontakthalpter/allergener3. Kontaktoverfølsomhetsreaksjonen (CHS) er en eksperimentell modell av ACD som kan studeres hos mus, marsvin og rotter og kan induseres ved lokal hudpåføring av reaktive kjemiske haptens oppløst i organiske løsningsmidler 4,5,6. Denne studien tar sikte på å beskrive en objektiv laboratoriemetode som kan bidra til å studere CHS-reaksjonen hos mus, som kan måles og kvantifiseres ved ulike tester.
CHS består av sensibiliseringsfaser (induksjon) og effektorfaser (utfordring). I dyremodeller binder haptens først kovalent til proteiner i kroppen for å skape neoantigener. I løpet av sensibiliseringsfasen fremmer aktiverte keratinocytter migrasjon og modning av huddendrittiske celler (SDC) ved å produsere proinflammatoriske cytokiner-tumornekrosefaktor α (TNF-α) og interleukin 1β (IL-1β)7. Epidermale Langerhans-celler (LCs) presenterer antigener under CHS-induksjons- og effektorfasene8. LC utsatt for hapten under sensibilisering fremmer induksjon av både regulatoriske og effektorceller9. Økende bevis fra flere studier tyder på at CHS-responser kan medieres av enten CD4+ MHC klasse II-begrensede Th1-celler, som lokalt frigjør interferon-γ (IFN-γ) til å benytte et karakteristisk inflammatorisk infiltrat, CD8+ MHC klasse I-begrensede Tc1-lymfocytter som også kan frigjøre IFN-γ men for det meste mediere cytotoksisk skade på keratinocytter, og nå også interleukin 17 (IL-17)-produserende Th17-celler10, 11. 11.
Det er utviklet flere ulike CHS-modeller med ulike arter1 2,13,14 og haptener (en detaljert sammenligning av ulike haptener, løsemidler og påføringstidspunkt er oppsummert i tabell 1). Musen, en ofte brukt laboratorieart, gir noen fordeler ved å studere CHS. Det er flere stammer, knockouts (KO) og transgene dyr blant mus sammenlignet med andre arter, noe som gjør dem til et veldig attraktivt dyr15. I tillegg krever CHS-modellen mange dyr, og mus er mer økonomiske her. Dyremodeller etterligner ikke ACD i alle aspekter; spesielt viser de crusting og desquamation, noe som ikke er vanlig for mennesker16,17. Funksjonene ved kronisk sykdom er utfordrende å reprodusere, hovedsakelig fordi den beskrevne modellen ikke antar anvendelsen av hapten i lang tid. Det har imidlertid blitt bekreftet her at mange av de viktige aspektene ved ACD er gjengitt. Det har også vist seg at, som hos mennesker, er disse funksjonene forbundet med lokale allergiske reaksjoner. Valget av hapten, dets løsningsmiddel og dets anvendelse skissert i denne protokollen ble diktert av det faktum at resultatene har blitt bekreftet av mange in vitro-tester, og at den ble testet og modifisert i laboratoriet i mange år til den nåværende versjonen ble etablert. Murine modeller tillater analyse av celleundergrupper eller cytokiner som er involvert i utviklingen av ACD og er avgjørende for prekliniske vurderinger av nye behandlinger.
CHS induseres via haptens, som binder seg til selvproteinantigener i huden og danner neoantigener. CHS medieres av lokal ekstravaskulær rekruttering av sirkulerende antigenspesifikke CHS-effektor T-celler, noe som resulterer i hevelse i det utfordrede vevet, med en topp på 24 timer etter eksponering av sekundærhuden for samme hapten6. Hevelsen i vevet skyldes hovedsakelig infiltrasjon av leukocytter og leukocyttavhengig fibrinavsetning24. Disse endringene kan op…
The authors have nothing to disclose.
Denne studien ble støttet av subvention SUBZ. A020.22.060 fra Medical University i Wroclaw, Polen, og ved tilskudd fra departementet for vitenskap og høyere utdanning N N401 545940 til MS og IP2012 0443 72 til MMS.
70% ethanol | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 65350-M | for surface disinfection |
96-well flat-bottom plates, polypropylene | Greiner Bio-One GmbH, Kremsmunster, Austria | 655101 | for MPO and Evans blue measurement – plates should be made of polypropylene, that has a lower binding capacity so proteins or DNA will not bind |
Acetone (ACS reagent, ≥99.5%) | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 179124 | |
Aluminum foil | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | Z185140 | |
Analytical balance | Sartorius Weighing Technology GmbH, Goettingen, Germany | PRACTUM224-1s, 29105177 | |
Automated tissue processor | MediMeas Instruments, Sarsehri, Haryana, India | MTP-E-212 | automatically prepare tissue samples by fixing, dehydrating, clearing, and infiltrating them with paraffin |
BD Vacutainer SST II Advance (tube with gel for obtaining serum) | Becton Dickinson (BD), Franklin Lakes, NJ, USA | BD 366882 | |
Bicinchoninic acid kit for protein determination | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | BCA1-1KT | |
Biotin Rat Anti-Mouse IgG1 | Becton Dickinson (BD Biosciences), Franklin Lakes, NJ, USA | 553441 | |
BSA (bovine serum albumine) | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | A9418 | protein assays & analysis, 2 mg/mL |
Cell strainer, pore size 70 μm | BIOLOGIX, China | 15-1070 | suitable for 50 mL tubes |
Coverslip | VWR, Radnor, Pennsylvania, United States | 631-1583 | 24 mm, but it possible to use different size |
Disposable pipettes capacity: 5 mL, 10 mL, 25 mL | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | Z740301, Z740302, Z740303 | |
DPBS (Dulbecco′s phosphate buffered saline) | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 14190144 | no calcium, no magnesium, mammalian cell culture |
DPX Mountant for histology | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 6522 | mounting media for H-E, might be used some other e.g, Canada balsam |
Dumont 5 tweezers – straight | Animalab, Poznan, Poland | 11251-10FST | surgical instruments for procedures on mice (should be steriled) |
Dumont 7 tweezers – bent | Animalab, Poznan, Poland | 11272-50FST | surgical instruments for procedures on mice (should be steriled) |
Eosin Y solution, alcoholic | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | HT110116 | |
Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 mL | Eppenforf, Germany | 3,01,20,086 | polypropylene |
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 2.0 mL | Eppenforf, Germany | 3,01,20,094 | polypropylene, round bottom (the homogenization beads can easily move) |
Ethanol 100% (absolute alkohol) | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 1.07017 | |
Ethanol 96% | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 1.59010 | |
Evans blue | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | E2129 | |
FBS (fetal bovine serum) | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | A3160802 | |
Formalin solution, neutral buffered, 10% | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | HT501128 | |
Formamide 99.5% (GC) | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | F7503 | |
Freezer -20 °C | Bosch, Germany | GSN54AW30 | |
Fridge +4 °C / freezer -20 °C | Bosch, Germany | KGV36V10 | mammalian Cell Culture, qualified, Brazil, 10 x 50 mL |
Glass microskope slides, SuperFrost Plus | VWR, Radnor, Pennsylvania, United States | 631-0108, 631-0446, 631-0447, 631-0448, 631-0449 | Slides that eliminates the need to apply adhesive materials or protein coatings, to preventing any tissue sections loss during staining. |
Graph Pad Prism | GraphPad Software Inc. | v. 9.4.0 | |
Grey soap | Pollena Ostrzeszów, Producent Chemii Gospodarczej Sp. Z.o.o. , Sp. K., Poland | Bialy jelen soap bar | grey Soap Bar Natural Hypoallergenic. Generally available product |
H2SO4 (sulfuric acid) 1 mol/l (1 M) | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 1.60313 | |
Harris hematoxylin solution | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | HHS16 | |
Hemocytometer | VWR, Avantor, U.S.A | 612-5719 | manual counting chamber is recommend, which is more accurate |
Hexadecyltrimethylammonium bromide | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | H5882 | |
Homogenizer | QIAGEN Hilden, Germany | Tissue Lyser LT, SN 23.1001/05234 | homogenizer with stainless steel beads (diameter 5 mm) for 2 mL centrifuge tubes |
Horseradish peroxidase streptavidin (HRP streptavidin) | Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA, USA | SA-5004-1 | |
Hydrogen peroxide solution (H202) | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | H1009 | |
Incubator Heracell 150i | Thermo Electron LED Gmbh, Germany | 41071068 | 37 oC in the atmosphere of 5 % CO2, and 65 0C for deparaffinization the sections for histology |
Ketamine 100 mg/mL, solution for injection | Biowet Pulawy Sp. z o.o., Pulawy, Poland | cat.# not avaliable | |
KH2PO4 (potassium dihydrogen phosphate) 99.995% anhydrous basis | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 1.05108 | |
Laboratory Centrifuge | Heraeus Megafuge 1.0R, Thermo Scientific, Germany | B00013899 | speed to 300 x g, with cooling to 4 0C |
Laboratory Centrifuge | Heraeus Fresco 21, Thermo Scientific, Germany | 75002425 | speed to 3,000 x g, with cooling to 4 0C |
Mask (FFP2) | VWR, Radnor, Pennsylvania, United States | 111-0917 | for working with ortho-dianisine dihydrochloride |
Mice | Breeding unit of the Chair of Biomedical Sciences, Faculty of Health Sciences, Jagiellonian University Medical College, Krakow, Poland | CBA/J, C57BL/6 | |
Micrometer | Mitutoyo, Tokyo, Japan | 193-111 | digit Outside Micrometer, Ratchet Stop, 0-25mm Range, 0.001mm Graduation, +/-0.002mm Accuracy, https://shop.mitutoyo.pl/web/mitutoyo/pl_PL/all/all/Mikrometr%20analogowy%20/PR/193-111/index.xhtml |
microplate, 96 well, microlon, high binding (for ELISA test) | Greiner Bio-One GmbH, Kremsmunster, Austria | 655061 | with maxi-sorp binding surfaces for reliable and reproducible results in colormetric assays |
Microscope with objectives | Leica Microsystems CMS GmbH, Germany | DM1000, 294011-082007 | histology presented in the paper was performed under ThermoFisher Scientific EVOS M5000 Imaging System, with objectives: FL 20X LWDPH, 0.40NA/3.1WD and FL 40X LWDPH 0.65NA/1.79WD |
Myeloperoxidase from human leukocytes (MPO standard) | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | M6908 | |
Na2HPO4 x 7 H2O (sodium phosphate dibasic heptahydrate) | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | S9390 | |
Olive-oil | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 75343 | pure, natural |
OptEIA Mouse IFN-γ ELISA Set | Becton Dickinson (BD Biosciences), Franklin Lakes, NJ, USA | 555138 | |
Ortho-dianisine dihydrochloride | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | D3252 | |
Paraffin wax | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 76242 | beads, waxy solid |
PBS (phosphate buffered saline) | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 20012027 | pH 7.2, mammalian cell culture |
ph meter | Elmetron, Poland | CP-401 | |
Pipettes, variable volume with tips | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | EP3123000900-1EA | 3-pack, Option 1, 0.5-10 uL/10-100 uL/100-1000 uL, includes epT.I.P.S. |
Razor blade | VWR, Radnor, Pennsylvania, United States | PERS94-0462 | scraper and cutter blades, single edge, aluminium spine, 100 blades per box, individually wrapped |
Rotary microtome | MRC Laboratory-Instruments, Essex, CM20 2HU UK | HIS-202A | |
Scissors – straight, sharp / sharp | Animalab, Poznan, Poland | 14060-10FST | Surgical instruments for procedures on mice (should be steriled) |
Screw cap (open top) | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 27056 | black polypropylene hole cap, for use with 22 mL vial with 20-400 thread |
Spectrophotometer | BioTek Instruments, U.S.A | 201446 | universal microplate spectrophotometer: λ range: 200 – 999 nm, absorbance measurement range: 0.000 – 4.000 Abs |
Staining dish 20 slides with rack | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | S6141 | e.g. 20 slide staining dishes complete with covers, slide rack and handle |
Sterile Disposable Biopsy Punch 6mm | Integra LifeSciences, Princeton, NJ, USA | 33-36 | |
Surgical scissors | Animalab, Poznan, Poland | 52138-46 | surgical instruments for procedures on mice (should be steriled) |
Tissue processing cassettes | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | Z672122 | tissue processing/ embedding cassettes with lid |
TMB Substrate Reagent Set | Becton Dickinson (BD Biosciences), Franklin Lakes, NJ, USA | 555214 | |
TNCB (2,4,6-trinitrochlorobenzene) | Tokyo Chemical Industry CO., LTD, Japan | C0307 | |
TNP-BSA (bovine serum albumin conjugated with 2,4,6-trinitrophenyl) | Biosearch Technologies LGC, Petaluma, CA, USA | T-5050 | |
T-PER (tissue protein extration reagent) | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 78510 | |
Tubes 15 mL sterile | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | CLS430055 (Corning) | polypropylene, conical bottom |
Tubes 50 mL, sterile | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | CLS430290 (Corning) | polypropylene, conical bottom |
Tween 20 | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | P1379 | |
Vials, screw top, clear glass (vial only) 22 mL | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 27173 | for the preparation of hapten, screwed on so that it does not evaporate |
Water bath | AJL Electronic, Poland | LW102 | |
Wax (paraffin) dispenser | VWR, Radnor, Pennsylvania, United States | 114-8737 | |
Xylazine (xylapan 20 mg/mL) solution for injection | Vetoquinol Biowet Sp. z o.o., Gorzow Wielkopolski, Poland | cat.# not avaliable | |
Xylene (histological grade) | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 534056 |