تضخيم إشارة التيراميد للتلطيخ المناعي للفسفرة المعتمدة على ZBP1 ل RIPK3 و MLKL بعد عدوى HSV-1 في الخلايا البشرية
Summary
يتيح تضخيم إشارة التيراميد أثناء تلطيخ الفلورسنت المناعي الكشف الحساس عن RIPK3 و MLKL المفسفر أثناء التنخر الناجم عن ZBP1 بعد الإصابة بفيروس HSV-1.
Abstract
يعد كيناز بروتين سيرين / ثريونين المتفاعل مع مستقبلات الكيناز 3 (RIPK3) ومجاله المختلط المختلط (MLKL) من المنظمين المهمين لمرض التنخر ، وهو شكل التهابي من موت الخلايا له وظائف مهمة مضادة للفيروسات. الفسفرة الذاتية ل RIPK3 تحفز الفسفرة وتفعيل بروتين الجلاد المكون للمسام من necroptosis MLKL. يؤدي الاتجار وقلة الغلومير من MLKL المفسفرة في غشاء الخلية إلى تحلل الخلية ، وهو سمة من سمات موت الخلايا النخرية. يتم تنشيط مستشعر الحمض النووي ZBP1 عن طريق الارتباط بالحمض النووي الريبي المزدوج الذي تقطعت به السبل على شكل Z (Z-RNA) بعد الإصابة بفيروسات الحمض النووي الريبي والحمض النووي. يقيد تنشيط ZBP1 الإصابة بالفيروس عن طريق إحداث موت الخلايا المنظم ، بما في ذلك التنخر ، للخلايا المضيفة المصابة. يسمح الفحص المجهري المناعي بتصور خطوات إشارات مختلفة في اتجاه مجرى التنخر بوساطة ZBP1 على أساس كل خلية. ومع ذلك ، فإن حساسية الفحص المجهري الفلوري القياسي ، باستخدام الأجسام المضادة الحالية المتاحة تجاريا ضد RIPK3 و MLKL البشري ، تمنع التصوير القابل للتكرار لهذه العلامات. هنا ، نصف إجراء تلطيخ محسن لسيرين (S) المفسفر RIPK3 (S227) و MLKL (S358) في خلايا HT-29 البشرية المصابة بفيروس الهربس البسيط 1 (HSV-1). يسمح إدراج خطوة تضخيم إشارة التيراميد (TSA) في بروتوكول تلطيخ الفلورسنت المناعي بالكشف المحدد عن RIPK3 المفسفر S227. علاوة على ذلك ، يزيد TSA بشكل كبير من حساسية الكشف عن MLKL المفسفر S358. معا ، تتيح هذه الطريقة تصور هذين الحدثين الحرجين للإشارات أثناء تحريض التنخر الناجم عن ZBP1.
Introduction
تفاعل مستقبلات سيرين / ثريونين بروتين كيناز 3 (RIPK3) ومجال كيناز السلالة المختلطة (MLKL) هي منظمات مركزية لموت الخلايا النخرية 1,2. Necroptosis هو شكل من أشكال lytic والتهابات من موت الخلايا المنظم تشارك في المناعة المضادة للفيروسات والتهاب ذاتي. يؤدي تنخر الخلايا المصابة بالفيروس إلى إيقاف تكاثر الفيروس على الفور. يؤدي تحلل الخلايا بعد تحريض التنخر أيضا إلى إطلاق أنماط جزيئية مرتبطة بالضرر ، والتي تحفز المناعة المضادة للفيروسات 3,4. يبدأ Necroptosis من خلال تنشيط RIPK3 بعد تفاعلات تفاعل RIP المتجانسة (RHIM) بوساطة واحد من ثلاثة جزيئات تنشيط المنبع: RIPK1 (عند مشاركة مستقبلات TNF 1 [TNFR1]) ، β الإنترفيرون الذي يحتوي على محول يحتوي على مجال TIR (TRIF ؛ عند اشتباك المستقبلات الشبيهة بالرقم 3 و 4) ، أو مستشعر الحمض النووي المضاد للفيروسات Z-DNA بروتين ملزم 1 (ZBP1) 1,2 . تستمر إشارات Necroptosis من خلال سلسلة من أحداث الفسفرة بدءا من الفسفرة الذاتية ل RIPK3. تعد الفسفرة الذاتية ل RIPK3 البشري في سيرين (S) 227 داخل مجال كيناز الخاص بها شرطا أساسيا للنخر من خلال تمكين التفاعل مع MLKL وتستخدم بشكل شائع كعلامة كيميائية حيوية لتنشيط RIPK3 البشري وموت الخلايا النخرية 1,5. بمجرد تنشيطه ، يقوم RIPK3 بفسفرة حلقة تنشيط MLKL عند ثريونين (T) 357 و S3581. يؤدي هذا إلى تغيير في تشكيل MLKL ، مما يؤدي إلى تعرض مجال حزمة الحلزون الأربعة N-terminal. ثم يقوم MLKL بقليل القلة والاتجار إلى غشاء الخلية حيث يشكل مسام من خلال إدخال الحزم الحلزونية الأربعة المكشوفة في طبقة الدهون المزدوجة ، مما يؤدي في النهاية إلى موت الخلية 2,6.
ZBP1 هو مستشعر حمض نووي مضاد للفيروسات يتعرف على الأحماض النووية اليسرى على شكل Z بما في ذلك الحمض النووي الريبي المزدوج الذي تقطعت به السبل في تشكيل Z (Z-RNA). يحدث ارتباط Z-RNA عبر نطاقين Zα متمركزين في النهاية N ل ZBP1. يعتقد أن Z-RNA المتراكم أثناء الإصابة بفيروس الحمض النووي الريبي والحمض النووي يشرك مباشرة ZBP1 7,8. يقوم ZBP1 المنشط بتجنيد RIPK3 من خلال RHIMs المركزية الخاصة به ويحفز موت الخلايا المنظم ، بما في ذلك التنخر 9,10. اعتمدت الفيروسات العديد من آليات الهروب لمواجهة تنخر الخلية المضيفة11 الناجم عن ZBP1. على سبيل المثال ، تحتوي الوحدة الفرعية 1 لاختزال الريبونوكليوتيد 1 لفيروس الهربس البسيط 1 (HSV-1) ، والمعروفة باسم ICP6 والمشفرة بواسطة UL39 ، على RHIM في نهايتها N التي تتداخل مع تنشيط RIPK3 بوساطة ZBP1 في الخلايا البشرية12،13،14،15. لا يقيد ZBP1 تكاثر الفيروس فحسب ، بل أظهرت دراسات الفئران أن تنشيط ZBP1 يسبب أمراضا التهابية ويحفز مناعة السرطان16،17،18،19،20،21. وبالتالي ، فإن البروتوكولات التي تكتشف أحداث الإشارات التي تحدث أثناء التنخر الناجم عن ZBP1 في الخلايا البشرية هي قيمة لتقييم دور ZBP1 في هذه العمليات.
تم تطوير تضخيم إشارة التيراميد (TSA) ، الذي يشار إليه أيضا باسم ترسيب المراسل المحفز (CARD) ، لتحسين حد الكشف ونسبة الإشارة إلى الضوضاء في المقايسات المناعية القائمة على الأجسام المضادة. أثناء TSA ، يمكن استخدام أي جسم مضاد أولي للكشف عن المستضد محل الاهتمام. يحفز بيروكسيديز الفجل (HRP) ، إلى جانب جسم مضاد ثانوي ، التراكم المحلي لجذور التيراميد البيوتينيلات في وجود بيروكسيد الهيدروجين. ثم تتفاعل جذور البيوتين تيراميد المنشطة هذه مع بقايا التيروزين القريبة لتشكيل روابط تساهمية. تشمل ركائز التيراميد-البيوتين المحتملة المستضد نفسه ، والأجسام المضادة الأولية والثانوية ، والبروتينات المجاورة. وبالتالي ، في حين أن TSA يحسن بشكل كبير من حساسية الفحص ، يتم فقد بعض الدقة المكانية. في الخطوة الأخيرة ، يتم الكشف عن جزيئات البيوتين باستخدام الستربتافيدين المسمى بالفلورسنت. يودع تفاعل HRP العديد من جزيئات تيراميد-بيوتين على المستضد محل الاهتمام أو بالقرب منه. هذا يزيد بشكل كبير من عدد مواقع ربط الستربتافيدين فلوروكروم ، وبالتالي تضخيم حساسية الفحص بشكل كبير (الشكل 1). بدلا من ذلك ، يمكن أن يقترن التيراميد مباشرة بالفلوروكروم ، مما يلغي الحاجة إلى الفلوروفورات المقترنة بالستربتافيدين. كانت الكيمياء الهيستولوجية المناعية للبروتين والتهجين في الموقع DNA / RNA من بين الطرق الأولى التي تم من خلالها استخدام TSA لتحسين شدة الإشارة22,23. في الآونة الأخيرة ، تم دمج TSA مع قياس التدفق الخلوي داخل الخلايا24 وقياس الطيف الكتلي25.
هنا ، نقدم بروتوكولا للكشف عن سيرين 227 RIPK3 البشري المفسفر (p-RIPK3 [S227]) و MLKL البشري المفسفر (p-MLKL [S358]) عند تنشيط ZBP1 بواسطة عدوى HSV-1 باستخدام الفحص المجهري المناعي. نحن نستخدم خط خلايا سرطان القولون والمستقيم البشري HT-29 الحساس للنخر والذي تم تحويله للتعبير بثبات عن ZBP1 البشري. أصيبت هذه الخلايا بسلالة HSV-1 تعبر عن بروتين ICP6 الطافر (HSV-1 ICP6mutRHIM) حيث تم استبدال أربعة أحماض أمينية أساسية داخل RHIM الفيروسي (VQCG) بألانين (AAAA) ، مما يجعل ICP6 غير قادر على منع التنخر بوساطة ZBP113،14،15. للتغلب على مشكلة انخفاض نسبة الإشارة إلى الضوضاء للأجسام المضادة المتاحة تجاريا حاليا والموجهة ضد p-RIPK3 و p-MLKL في التلوين المناعي26 ، نقوم بإجراء خطوة تضخيم إشارة التيراميد (TSA) (الشكل 1) ، مما يؤدي إلى الكشف القوي عن p-RIPK3 البشري (S227) ويحسن حساسية الكشف عن p-MLKL البشري (S358) بترتيب من حيث الحجم.
Protocol
Representative Results
Discussion
يصف بروتوكول التلوين المناعي هذا استخدام تضخيم إشارة التيراميد (TSA) لزيادة الحساسية لأحداث الإشارات لمسار الإشارات النخرية البشرية التي يصعب اكتشافها ، بما في ذلك فسفرة RIPK3 و MLKL26. يؤدي تضمين خطوة TSA إلى تحسين عتبة الكشف بشكل كبير من p-RIPK3 (S227) و p-MLKL (S358) ويزيد من حساسية إجهاد p-MLKL (S3…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر VIB Bioimaging Core على التدريب والدعم والوصول إلى حديقة الأدوات. يتم دعم JN من خلال زمالة الدكتوراه من مؤسسة الأبحاث فلاندرز (FWO). تم دعم البحث في مجموعة JM من خلال منحة Odysseus II (G0H8618N) ، و EOS INFLADIS (40007512) ، ومنحة بحثية مبتدئة (G031022N) من مؤسسة الأبحاث فلاندرز (FWO) ، ومنحة إثبات المفهوم من CRIG للباحثين الشباب ، ومن جامعة غنت. تم دعم البحث في مجموعة P.V. من قبل EOS MODEL-IDI (30826052) و EOS INFLADIS (40007512) ومنح أبحاث FWO العليا (G.0C76.18N و G.0B71.18N و G.0B96.20N و G.0A9322N) و Methusalem (BOF16 / MET_V/007) و iBOF20 / IBF / 039 ATLANTIS و Foundation Against Cancer (F / 2016/865 و F / 2020/1505) واتحادات CRIG و GIGG و VIB.
Materials
| Antibodies | |||
| Anti-rabbit HRP | Agilent Technologies Belgium | K4002 | Envision+ System-HRP Labelled Polymer anti-rabbit |
| Goat anti-mouse DyLight 633 | Thermofisher | 35513 | Secundary antibody |
| HSV-1 ICP0 | Santa Cruz | sc-53070 | Mouse anti-ICP0(HSV-1) antibody |
| IAV-PR8 mouse serum | In house production | xx | Mouse anti-IAV-PR8 polyclonal antibody |
| pMLKL | Abcam | ab187091 | Rabbit anti-MLKL-phospho S358 antibody |
| pRIPK3 | Abcam | ab209384 | Rabbit anti-RIPK3-phospho S227 antibody |
| Fluorophores | |||
| DAPI | Thermofisher | D21490 | To visualise the nucleus of the cells |
| Streptavidin coupled to Alexa Fluor 568 | Thermofisher | S11226 | To visulalise biotin molecules |
| Compounds | |||
| 30% H2O2 | Sigma | H1009 | Oxidising substrate, necessary for HRP activity |
| 4% PFA | SANBIO | AR1068 | To fix/crosslink the cells |
| Biotinyl-tyramide | R&D Systems | 6241 | To amplify signal, HRP substrate |
| BV-6 | Selleckchem | S7597 | BV6 IAP Inhibitor |
| For cell culture: to detach the cells | |||
| 8.0 g/L NaCl | |||
| 0.4 g/L disodium salt of EDTA | |||
| EDTA 0.04% | In house formulation | 1.1 g/L Na2HPO4 | |
| 0.2 g/L NaH2PO4 | |||
| 0.2 g/L KCl | |||
| 0.2 g/L Glucose | |||
| Fetal Bovine serum | TICO | FBS EU XXX | For cell culture, maintaining cell culture; lot number: 90439 |
| GSK'840 | Aobious | AOB0917 | RIPK3 kinase inhibitor |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | For cell culture, maintaining cell culture |
| MAXblock | Active Motif | 15252 | Blocking solution |
| PBS | Gibco | 10444402 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | For cell culture, maintaining cell culture |
| TNF-α | In house production | – | Signaling molecule, able to trigger cell death in combination with BV6 and zVAD |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787-50ML | To permeabilise the cells |
| Trypan blue | Merck | 11732 | For cell counting, used as live/dead marker at 0,1% |
| Trypsine | Sigma-Aldrich | T4424 | For cell culture: to detach the cells |
| zVAD | Bachem | BACE4026865.0005 | Z-Val-Ala-DL-Asp-fluoromethylketone |
| Material | |||
| µ-Slide 8 well high glass bottom | iBidi | 80807 | To culture the cells |
| Cotton Preping Balls-size medium | Electron Microscopy Sciences | 71001-10 | To clean the objectives |
| Immersol 518 F / 30 °C | ZEISS | 444970-9000-000 | To visualise the sample at high magnifications |
| Lens Cleaner | ZEISS | 000000-0105-200 | To clean the objectives |
| LSM880 Fast Airyscan confocal microscope | To visualise the sample | ||
| Software | |||
| Excel | Office | xx | To process the data |
| Prism 9 | Graphpad | xx | To analyse the data- statistical testing and graph generation |
| Volocity 6.3 | Volocity | xx | To perform quantifications |
| Zen black | ZEISS | xx | To aquire and process images |
| Zen blue | ZEISS | xx | To visualise images |
| Viruses | |||
| HSV-1 (mutRHIM) F strain | produced by Dr. Jiahuai Han | in house replication | HSV-1 as a trigger for necroptosis; RHIM core domain of UL39/ICP6 is mutated (VQCG>AAAA) |
| HSV-1 (WT) F strain | Produced by Dr. Jiahuai Han | in house replication | HSV-1 (WT) as a negative control for necroptosis induction (ICP6 inhibition) |
| IAV PR8 | in house stock | in house replication | IAV as a trigger for necroptosis |
References
- Meng, Y., Sandow, J. J., Czabotar, P. E., Murphy, J. M. The regulation of necroptosis by post-translational modifications. Cell Death & Differentiation. 28 (3), 861-883 (2021).
- Petrie, E. J., Czabotar, P. E., Murphy, J. M. The structural basis of necroptotic cell death signaling. Trends in Biochemical Sciences. 44 (1), 53-63 (2019).
- Mocarski, E. S., Guo, H., Kaiser, W. J. Necroptosis: The Trojan horse in cell autonomous antiviral host defense. Virology. 479-480, 160-166 (2015).
- Nailwal, H., Chan, F. K. Necroptosis in anti-viral inflammation. Cell Death & Differentiation. 26 (1), 4-13 (2019).
- Meng, Y., et al. Human RIPK3 maintains MLKL in an inactive conformation prior to cell death by necroptosis. Nature Communications. 12 (1), 6783 (2021).
- Samson, A. L., Garnish, S. E., Hildebrand, J. M., Murphy, J. M. Location, location, location: A compartmentalized view of TNF-induced necroptotic signaling. Science Signalling. 14 (668), (2021).
- Koehler, H., et al. Vaccinia virus E3 prevents sensing of Z-RNA to block ZBP1-dependent necroptosis. Cell Host Microbe. 29 (8), 1266-1276 (2021).
- Balachandran, S., Mocarski, E. S. Viral Z-RNA triggers ZBP1-dependent cell death. Current Opinion in Virology. 51, 134-140 (2021).
- Kuriakose, T., Kanneganti, T. D. ZBP1: Innate sensor regulating cell death and inflammation. Trends in Immunology. 39 (2), 123-134 (2018).
- Maelfait, J., Liverpool, L., Rehwinkel, J. Nucleic acid sensors and programmed cell death. Journal of Molecular Biology. 432 (2), 552-568 (2020).
- Verdonck, S., Nemegeer, J., Vandenabeele, P., Maelfait, J. Viral manipulation of host cell necroptosis and pyroptosis. Trends in Microbiology. 30 (6), 593-605 (2022).
- Guo, H., et al. Herpes simplex virus suppresses necroptosis in human cells. Cell Host & Microbe. 17 (2), 243-251 (2015).
- Yu, X., et al. Herpes simplex virus 1 (HSV-1) and HSV-2 mediate species-specific modulations of programmed necrosis through the viral ribonucleotide reductase large subunit R1. Journal of Virology. 90 (2), 1088-1095 (2016).
- Huang, Z., et al. RIP1/RIP3 binding to HSV-1 ICP6 initiates necroptosis to restrict virus propagation in mice. Cell Host & Microbe. 17 (2), 229-242 (2015).
- Guo, H., et al. Species-independent contribution of ZBP1/DAI/DLM-1-triggered necroptosis in host defense against HSV1. Cell Death & Disease. 9 (8), 816 (2018).
- Devos, M., et al. Sensing of endogenous nucleic acids by ZBP1 induces keratinocyte necroptosis and skin inflammation. The Journal of Experimental Medicine. 217 (7), 20191913 (2020).
- Jiao, H., et al. Z-nucleic-acid sensing triggers ZBP1-dependent necroptosis and inflammation. Nature. 580 (7803), 391-395 (2020).
- de Reuver, R., et al. ADAR1 prevents autoinflammation by suppressing spontaneous ZBP1 activation. Nature. 607 (7920), 784-789 (2022).
- Jiao, H., et al. ADAR1 averts fatal type I interferon induction by ZBP1. Nature. 607 (7920), 776-783 (2022).
- Hubbard, N. W., et al. ADAR1 mutation causes ZBP1-dependent immunopathology. Nature. 607 (7920), 769-775 (2022).
- Zhang, T., et al. ADAR1 masks the cancer immunotherapeutic promise of ZBP1-driven necroptosis. Nature. 606 (7914), 594-602 (2022).
- Adams, J. C. Biotin amplification of biotin and horseradish peroxidase signals in histochemical stains. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 40 (10), 1457-1463 (1992).
- Speel, E. J., Hopman, A. H., Komminoth, P. Tyramide signal amplification for DNA and mRNA in situ hybridization. Methods in Molecular Biology. 326, 33-60 (2006).
- Clutter, M. R., Heffner, G. C., Krutzik, P. O., Sachen, K. L., Nolan, G. P. Tyramide signal amplification for analysis of kinase activity by intracellular flow cytometry. Cytometry A. 77 (11), 1020-1031 (2010).
- Dopie, J., Sweredoski, M. J., Moradian, A., Belmont, A. S. Tyramide signal amplification mass spectrometry (TSA-MS) ratio identifies nuclear speckle proteins. The Journal of Cell Biology. 219 (9), 201910207 (2020).
- Samson, A. L., et al. A toolbox for imaging RIPK1, RIPK3, and MLKL in mouse and human cells. Cell Death and Differentiation. 28 (7), 2126-2144 (2021).
- De Groote, P., et al. Generation of a new gateway-compatible inducible lentiviral vector platform allowing easy derivation of co-transduced cells. Biotechniques. 60 (5), 252-259 (2016).
- Ali, M., Roback, L., Mocarski, E. S. Herpes simplex virus 1 ICP6 impedes TNF receptor 1-induced necrosome assembly during compartmentalization to detergent-resistant membrane vesicles. The Journal of Biological Chemistry. 294 (3), 991-1004 (2019).
- Mandal, P., et al. RIP3 induces apoptosis independent of pronecrotic kinase activity. Moleular Cell. 56 (4), 481-495 (2014).
- Zhang, T., et al. Influenza virus Z-RNAs induce ZBP1-mediated necroptosis. Cell. 180 (6), 1115-1129 (2020).
- Garnish, S. E., et al. Conformational interconversion of MLKL and disengagement from RIPK3 precede cell death by necroptosis. Nature Communications. 12 (1), 2211 (2021).
- Clay, H., Ramakrishnan, L. Multiplex fluorescent in situ hybridization in zebrafish embryos using tyramide signal amplification. Zebrafish. 2 (2), 105-111 (2005).
- Parra, E. R., et al. Procedural requirements and recommendations for multiplex immunofluorescence tyramide signal amplification assays to support translational oncology studies. Cancers. 12 (2), 255 (2020).
