הגברת אות טירמיד להכתמה אימונופלואורסצנטית של זרחון תלוי ZBP1 של RIPK3 ו- MLKL לאחר זיהום HSV-1 בתאים אנושיים
Summary
הגברת אות טירמיד במהלך צביעה אימונופלואורסצנטית מאפשרת זיהוי רגיש של RIPK3 ו-MLKL שעברו זרחון במהלך נקרופטוזיס הנגרם על-ידי ZBP1 לאחר זיהום ב-HSV-1.
Abstract
קולטן קינאז/ת’רונין קינאז 3 (RIPK3) והסובסטרט שלו, השושלת המעורבת קינאז דמוית תחום (MLKL) הם מווסתים קריטיים של נקרופטוזיס, צורה דלקתית של מוות תאי עם פונקציות אנטי-ויראליות חשובות. אוטופוספורילציה של RIPK3 משרה זרחון והפעלה של חלבון התליין יוצר הנקבוביות של נקרופטוזיס MLKL. סחר ואוליגומריזציה של MLKL זרחני בקרום התא גורם לתזה של התא, האופיינית למוות תאי נקרופטוטי. חיישן חומצות הגרעין ZBP1 מופעל על ידי קשירה ל-RNA דו-גדילי (Z-RNA) בצורת Z שמאלית לאחר זיהום בנגיפי RNA ו-DNA. הפעלת ZBP1 מגבילה את ההדבקה בנגיף על ידי גרימת מוות תאי מוסדר, כולל נקרופטוזיס, של תאים מארחים נגועים. מיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית מאפשרת הדמיה של שלבי איתות שונים במורד הזרם של נקרופטוזיס בתיווך ZBP1 על בסיס לכל תא. עם זאת, הרגישות של מיקרוסקופיה פלואורסצנטית סטנדרטית, המשתמשת בנוגדנים ספציפיים לפוספו הזמינים באופן מסחרי נגד RIPK3 ו-MLKL אנושיים, מונעת הדמיה ניתנת לשחזור של סמנים אלה. כאן אנו מתארים הליך צביעה אופטימלי עבור RIPK3 זרחני (S227) ו-MLKL (S358) אנושיים בתאי HT-29 אנושיים הנגועים בנגיף הרפס סימפלקס 1 (HSV-1). הכללת שלב הגברת אות טירמיד (TSA) בפרוטוקול הכתם האימונופלואורסצנטי מאפשרת זיהוי ספציפי של S227 זרחני RIPK3. יתר על כן, TSA מגביר מאוד את הרגישות של זיהוי של S358 זרחני MLKL. יחד, שיטה זו מאפשרת הדמיה של שני אירועי איתות קריטיים אלה במהלך אינדוקציה של נקרופטוזיס המושרה על ידי ZBP1.
Introduction
סרין/תראונין חלבון קינאז 3 (RIPK3) ושושלת מעורבת קינאז דמוית תחום (MLKL) הם הרגולטורים המרכזיים של מוות תאי נקרופטוטי 1,2. נקרופטוזיס היא צורה ליטית ודלקתית של מוות תאי מווסת המעורבת בחסינות אנטי-ויראלית ובדלקת אוטומטית. נקרופטוזיס של תאים נגועים בנגיף מכבה מיד את שכפול הנגיף. תזה תאית בעקבות אינדוקציה של נקרופטוזיס משחררת גם דפוסים מולקולריים הקשורים לנזק, המעוררים חסינות אנטי-ויראלית 3,4. נקרופטוזה מופעלת על ידי הפעלה של RIPK3 בעקבות אינטראקציות בתיווך מוטיב אינטראקציה הומוטיפית של RIP (RHIM) עם אחת משלוש מולקולות מפעילות במעלה הזרם: RIPK1 (על מעורבות קולטן TNF 1 [TNFR1]), אינטרפרון-β המכילים מתאם המכיל תחום TIR (TRIF; על מעורבות קולטן דמוי אגרה 3 ו-4), או חיישן חומצות הגרעין האנטי-ויראליות Z-DNA קושר חלבון 1 (ZBP1)1,2 . איתות נקרופטוזיס ממשיך בסדרה של אירועי זרחון המתחילים באוטופוספורילציה של RIPK3. האוטו-פוספורילציה של RIPK3 אנושי בסרין (S)227 בתוך תחום הקינאז שלו היא תנאי מוקדם לנקרופטוזיס בכך שהיא מאפשרת את האינטראקציה עם MLKL והיא משמשת בדרך כלל כסמן ביוכימי להפעלת RIPK3 אנושי ולמוות תאי נקרופטוטי 1,5. לאחר ההפעלה, RIPK3 פוספורילטים את לולאת ההפעלה של MLKL בתראונין (T)357 ו-S3581. זה גורם לשינוי בקונפורמציה של MLKL, וכתוצאה מכך לחשיפה של תחום צרור ארבעת הסלילים N-terminal. לאחר מכן MLKL אוליגומרית ועוברת לקרום התא, שם היא יוצרת נקבובית דרך החדרת ארבעת צרורות הסליל החשופים לדו-שכבת השומנים, מה שמוביל בסופו של דבר למוות תאי 2,6.
ZBP1 הוא חיישן חומצות גרעין אנטי-ויראליות המזהה חומצות גרעין שמאליות בצורת Z, כולל RNA דו-גדילי בקונפורמציה Z (Z-RNA). קשירת Z-RNA מתרחשת באמצעות שני תחומי Zα הממוקמים במסוף N של ZBP1. Z-RNA המצטבר במהלך הידבקות בנגיף ה-RNA והדנ”א נחשב כמעורב ישירות ב-ZBP1 7,8. ZBP1 מופעל מגייס את RIPK3 דרך ה-RHIMs המרכזיים שלו וגורם למוות תאי מווסת, כולל נקרופטוזיס 9,10. וירוסים אימצו מנגנוני בריחה רבים כדי לנטרל נקרופטוזיס של תאים מארחים המושרה על-ידי ZBP111. לדוגמה, נגיף ההרפס סימפלקס 1 (HSV-1) ריבונוקלאוטיד רדוקטאז תת-יחידה 1, המכונה ICP6 ומקודד על ידי UL39, מכיל RHIM במסוף N שלו שמפריע להפעלת RIPK3 בתיווך ZBP1 בתאים אנושיים12,13,14,15. ZBP1 לא רק מגביל שכפול נגיפי, אלא שמחקרים בעכברים הראו כי הפעלת ZBP1 גורמת למחלות דלקתיות וממריצה חסינות לסרטן 16,17,18,19,20,21. פרוטוקולים המזהים אירועי איתות המתרחשים במהלך נקרופטוזיס המושרה על-ידי ZBP1 בתאים אנושיים הם, לפיכך, בעלי ערך להערכת תפקידו של ZBP1 בתהליכים אלה.
הגברה של אות טירמיד (TSA), המכונה גם תצהיר מדווח מזורז (CARD), פותחה כדי לשפר את גבול הגילוי ואת יחס האות לרעש בבדיקות חיסוניות מבוססות נוגדנים. במהלך TSA, כל נוגדן ראשוני יכול לשמש כדי לזהות את האנטיגן של עניין. חזרת פרוקסידאז (HRP), יחד עם נוגדן משני, מזרז את ההצטברות המקומית של רדיקלים טירמידים ביוטינילטים בנוכחות מי חמצן. רדיקלים ביוטין-טירמיד פעילים אלה מגיבים עם שאריות טירוזין פרוקסימליות ליצירת קשרים קוולנטיים. מצעים פוטנציאליים של טירמיד-ביוטין כוללים את האנטיגן עצמו, את הנוגדנים הראשוניים והמשניים ואת החלבונים השכנים. לכן, בעוד TSA משפר באופן משמעותי את הרגישות של הבדיקה, חלק מהרזולוציה המרחבית שלה הולכת לאיבוד. בשלב אחרון, מולקולות ביוטין מזוהות באמצעות סטרפטווידין עם תווית פלואורסצנטית. תגובת HRP מפקידה מולקולות טירמיד-ביוטין רבות על האנטיגן המעניין או בסמוך לו. זה מגדיל מאוד את מספר אתרי הקישור של סטרפטאבידין-פלואורוכרום, ובכך מגביר מאוד את הרגישות של הבדיקה (איור 1). לחלופין, ניתן להצמיד טירמיד ישירות לפלואורוכרום, ובכך לבטל את הצורך בפלואורופורים מצומדים לסטרפטאווידין. אימונוהיסטוכימיה של חלבונים והכלאה של דנ”א/רנ”א באתרו היו בין השיטות הראשונות שבהן נעשה שימוש ב-TSA כדי לשפר את עוצמות האות22,23. לאחרונה, TSA שולבה עם ציטומטריה של זרימה תוך תאית24 וספקטרומטריית מסה25.
כאן אנו מציגים פרוטוקול לזיהוי RIPK3 אנושי זרחני 227 (p-RIPK3 [S227]) ו-MLKL אנושי זרחני (p-MLKL [S358]) עם הפעלת ZBP1 על ידי זיהום HSV-1 באמצעות מיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית. אנו משתמשים בקו תאי אדנוקרצינומה אנושיים רגישים לנקרופטוזיס HT-29 שהועתקו כדי לבטא ביציבות ZBP1 אנושי. תאים אלה היו נגועים בזן HSV-1 המבטא חלבון ICP6 מוטנטי (HSV-1ICP6 mutRHIM) שבו ארבע חומצות אמינו מרכזיות בתוך ה-RHIM הנגיפי (VQCG) הוחלפו באלנינים (AAAA), ובכך ה-ICP6 לא הצליח לחסום נקרופטוזיס בתיווך ZBP113,14,15. כדי להתגבר על הבעיה של יחס אות לרעש הנמוך של הנוגדנים הזמינים כיום באופן מסחרי המכוונים נגד p-RIPK3 ו-p-MLKL באימונוסטינינג26, אנו מבצעים שלב הגברת אות טירמיד (TSA) (איור 1), אשר מביא לזיהוי חזק של p-RIPK3 אנושי (S227) ומשפר את רגישות הגילוי של p-MLKL אנושי (S358) בסדר גודל.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול צביעה אימונופלואורסצנטי זה מתאר את השימוש בהגברת אותות טירמיד (TSA) כדי להגביר את הרגישות לאירועי איתות של מסלול האיתות הנקרופטוטי האנושי שקשה לזהותם, כולל זרחון של RIPK3 ו- MLKL26. הכללת שלב TSA משפרת באופן משמעותי את סף הזיהוי של p-RIPK3 (S227) ו- p-MLKL (S358) ומגבירה את הרגישות של מאמץ …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות לליבת ההדמיה הביולוגית VIB על האימון, התמיכה והגישה לפארק המכשירים. J.N. נתמך על ידי מלגת דוקטורט מקרן המחקר פלנדריה (FWO). המחקר בקבוצת J.M. נתמך על ידי מענק אודיסאוס השני (G0H8618N), EOS INFLADIS (40007512), מענק מחקר זוטר (G031022N) מקרן המחקר פלנדריה (FWO), מענק הוכחת היתכנות לחוקר צעיר של CRIG, ועל ידי אוניברסיטת גנט. המחקר בקבוצת P.V. נתמך על ידי EOS MODEL-IDI (30826052), EOS INFLADIS (40007512), מענקי מחקר בכירים של FWO (G.0C76.18N, G.0B71.18N, G.0B96.20N, G.0A9322N), Methusalem (BOF16/MET_V/007), iBOF20/IBF/039 אטלנטיס, הקרן נגד סרטן (F/2016/865, F/2020/1505), קונסורציום CRIG ו-GIGG ו-VIB.
Materials
| Antibodies | |||
| Anti-rabbit HRP | Agilent Technologies Belgium | K4002 | Envision+ System-HRP Labelled Polymer anti-rabbit |
| Goat anti-mouse DyLight 633 | Thermofisher | 35513 | Secundary antibody |
| HSV-1 ICP0 | Santa Cruz | sc-53070 | Mouse anti-ICP0(HSV-1) antibody |
| IAV-PR8 mouse serum | In house production | xx | Mouse anti-IAV-PR8 polyclonal antibody |
| pMLKL | Abcam | ab187091 | Rabbit anti-MLKL-phospho S358 antibody |
| pRIPK3 | Abcam | ab209384 | Rabbit anti-RIPK3-phospho S227 antibody |
| Fluorophores | |||
| DAPI | Thermofisher | D21490 | To visualise the nucleus of the cells |
| Streptavidin coupled to Alexa Fluor 568 | Thermofisher | S11226 | To visulalise biotin molecules |
| Compounds | |||
| 30% H2O2 | Sigma | H1009 | Oxidising substrate, necessary for HRP activity |
| 4% PFA | SANBIO | AR1068 | To fix/crosslink the cells |
| Biotinyl-tyramide | R&D Systems | 6241 | To amplify signal, HRP substrate |
| BV-6 | Selleckchem | S7597 | BV6 IAP Inhibitor |
| For cell culture: to detach the cells | |||
| 8.0 g/L NaCl | |||
| 0.4 g/L disodium salt of EDTA | |||
| EDTA 0.04% | In house formulation | 1.1 g/L Na2HPO4 | |
| 0.2 g/L NaH2PO4 | |||
| 0.2 g/L KCl | |||
| 0.2 g/L Glucose | |||
| Fetal Bovine serum | TICO | FBS EU XXX | For cell culture, maintaining cell culture; lot number: 90439 |
| GSK'840 | Aobious | AOB0917 | RIPK3 kinase inhibitor |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | For cell culture, maintaining cell culture |
| MAXblock | Active Motif | 15252 | Blocking solution |
| PBS | Gibco | 10444402 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | For cell culture, maintaining cell culture |
| TNF-α | In house production | – | Signaling molecule, able to trigger cell death in combination with BV6 and zVAD |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787-50ML | To permeabilise the cells |
| Trypan blue | Merck | 11732 | For cell counting, used as live/dead marker at 0,1% |
| Trypsine | Sigma-Aldrich | T4424 | For cell culture: to detach the cells |
| zVAD | Bachem | BACE4026865.0005 | Z-Val-Ala-DL-Asp-fluoromethylketone |
| Material | |||
| µ-Slide 8 well high glass bottom | iBidi | 80807 | To culture the cells |
| Cotton Preping Balls-size medium | Electron Microscopy Sciences | 71001-10 | To clean the objectives |
| Immersol 518 F / 30 °C | ZEISS | 444970-9000-000 | To visualise the sample at high magnifications |
| Lens Cleaner | ZEISS | 000000-0105-200 | To clean the objectives |
| LSM880 Fast Airyscan confocal microscope | To visualise the sample | ||
| Software | |||
| Excel | Office | xx | To process the data |
| Prism 9 | Graphpad | xx | To analyse the data- statistical testing and graph generation |
| Volocity 6.3 | Volocity | xx | To perform quantifications |
| Zen black | ZEISS | xx | To aquire and process images |
| Zen blue | ZEISS | xx | To visualise images |
| Viruses | |||
| HSV-1 (mutRHIM) F strain | produced by Dr. Jiahuai Han | in house replication | HSV-1 as a trigger for necroptosis; RHIM core domain of UL39/ICP6 is mutated (VQCG>AAAA) |
| HSV-1 (WT) F strain | Produced by Dr. Jiahuai Han | in house replication | HSV-1 (WT) as a negative control for necroptosis induction (ICP6 inhibition) |
| IAV PR8 | in house stock | in house replication | IAV as a trigger for necroptosis |
References
- Meng, Y., Sandow, J. J., Czabotar, P. E., Murphy, J. M. The regulation of necroptosis by post-translational modifications. Cell Death & Differentiation. 28 (3), 861-883 (2021).
- Petrie, E. J., Czabotar, P. E., Murphy, J. M. The structural basis of necroptotic cell death signaling. Trends in Biochemical Sciences. 44 (1), 53-63 (2019).
- Mocarski, E. S., Guo, H., Kaiser, W. J. Necroptosis: The Trojan horse in cell autonomous antiviral host defense. Virology. 479-480, 160-166 (2015).
- Nailwal, H., Chan, F. K. Necroptosis in anti-viral inflammation. Cell Death & Differentiation. 26 (1), 4-13 (2019).
- Meng, Y., et al. Human RIPK3 maintains MLKL in an inactive conformation prior to cell death by necroptosis. Nature Communications. 12 (1), 6783 (2021).
- Samson, A. L., Garnish, S. E., Hildebrand, J. M., Murphy, J. M. Location, location, location: A compartmentalized view of TNF-induced necroptotic signaling. Science Signalling. 14 (668), (2021).
- Koehler, H., et al. Vaccinia virus E3 prevents sensing of Z-RNA to block ZBP1-dependent necroptosis. Cell Host Microbe. 29 (8), 1266-1276 (2021).
- Balachandran, S., Mocarski, E. S. Viral Z-RNA triggers ZBP1-dependent cell death. Current Opinion in Virology. 51, 134-140 (2021).
- Kuriakose, T., Kanneganti, T. D. ZBP1: Innate sensor regulating cell death and inflammation. Trends in Immunology. 39 (2), 123-134 (2018).
- Maelfait, J., Liverpool, L., Rehwinkel, J. Nucleic acid sensors and programmed cell death. Journal of Molecular Biology. 432 (2), 552-568 (2020).
- Verdonck, S., Nemegeer, J., Vandenabeele, P., Maelfait, J. Viral manipulation of host cell necroptosis and pyroptosis. Trends in Microbiology. 30 (6), 593-605 (2022).
- Guo, H., et al. Herpes simplex virus suppresses necroptosis in human cells. Cell Host & Microbe. 17 (2), 243-251 (2015).
- Yu, X., et al. Herpes simplex virus 1 (HSV-1) and HSV-2 mediate species-specific modulations of programmed necrosis through the viral ribonucleotide reductase large subunit R1. Journal of Virology. 90 (2), 1088-1095 (2016).
- Huang, Z., et al. RIP1/RIP3 binding to HSV-1 ICP6 initiates necroptosis to restrict virus propagation in mice. Cell Host & Microbe. 17 (2), 229-242 (2015).
- Guo, H., et al. Species-independent contribution of ZBP1/DAI/DLM-1-triggered necroptosis in host defense against HSV1. Cell Death & Disease. 9 (8), 816 (2018).
- Devos, M., et al. Sensing of endogenous nucleic acids by ZBP1 induces keratinocyte necroptosis and skin inflammation. The Journal of Experimental Medicine. 217 (7), 20191913 (2020).
- Jiao, H., et al. Z-nucleic-acid sensing triggers ZBP1-dependent necroptosis and inflammation. Nature. 580 (7803), 391-395 (2020).
- de Reuver, R., et al. ADAR1 prevents autoinflammation by suppressing spontaneous ZBP1 activation. Nature. 607 (7920), 784-789 (2022).
- Jiao, H., et al. ADAR1 averts fatal type I interferon induction by ZBP1. Nature. 607 (7920), 776-783 (2022).
- Hubbard, N. W., et al. ADAR1 mutation causes ZBP1-dependent immunopathology. Nature. 607 (7920), 769-775 (2022).
- Zhang, T., et al. ADAR1 masks the cancer immunotherapeutic promise of ZBP1-driven necroptosis. Nature. 606 (7914), 594-602 (2022).
- Adams, J. C. Biotin amplification of biotin and horseradish peroxidase signals in histochemical stains. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 40 (10), 1457-1463 (1992).
- Speel, E. J., Hopman, A. H., Komminoth, P. Tyramide signal amplification for DNA and mRNA in situ hybridization. Methods in Molecular Biology. 326, 33-60 (2006).
- Clutter, M. R., Heffner, G. C., Krutzik, P. O., Sachen, K. L., Nolan, G. P. Tyramide signal amplification for analysis of kinase activity by intracellular flow cytometry. Cytometry A. 77 (11), 1020-1031 (2010).
- Dopie, J., Sweredoski, M. J., Moradian, A., Belmont, A. S. Tyramide signal amplification mass spectrometry (TSA-MS) ratio identifies nuclear speckle proteins. The Journal of Cell Biology. 219 (9), 201910207 (2020).
- Samson, A. L., et al. A toolbox for imaging RIPK1, RIPK3, and MLKL in mouse and human cells. Cell Death and Differentiation. 28 (7), 2126-2144 (2021).
- De Groote, P., et al. Generation of a new gateway-compatible inducible lentiviral vector platform allowing easy derivation of co-transduced cells. Biotechniques. 60 (5), 252-259 (2016).
- Ali, M., Roback, L., Mocarski, E. S. Herpes simplex virus 1 ICP6 impedes TNF receptor 1-induced necrosome assembly during compartmentalization to detergent-resistant membrane vesicles. The Journal of Biological Chemistry. 294 (3), 991-1004 (2019).
- Mandal, P., et al. RIP3 induces apoptosis independent of pronecrotic kinase activity. Moleular Cell. 56 (4), 481-495 (2014).
- Zhang, T., et al. Influenza virus Z-RNAs induce ZBP1-mediated necroptosis. Cell. 180 (6), 1115-1129 (2020).
- Garnish, S. E., et al. Conformational interconversion of MLKL and disengagement from RIPK3 precede cell death by necroptosis. Nature Communications. 12 (1), 2211 (2021).
- Clay, H., Ramakrishnan, L. Multiplex fluorescent in situ hybridization in zebrafish embryos using tyramide signal amplification. Zebrafish. 2 (2), 105-111 (2005).
- Parra, E. R., et al. Procedural requirements and recommendations for multiplex immunofluorescence tyramide signal amplification assays to support translational oncology studies. Cancers. 12 (2), 255 (2020).
