Method Article

인간 세포에서 HSV-1 감염 후 RIPK3 및 MLKL의 ZBP1 의존성 인산화의 면역형광염색을 위한 티라마이드 신호 증폭

DOI:

10.3791/64332

⸱

October 20th, 2022

 ,  ,  , 
1VIB-UGent Center for Inflammation Research, 2Department of Biomedical Molecular Biology, Ghent University

In This Article

Summary

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면역형광 염색 중 티라마이드 신호 증폭은 HSV-1 감염 후 ZBP1 유발 괴사 동안 인산화된 RIPK3 및 MLKL의 민감한 검출을 가능하게 합니다.

Abstract

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키나아제 수용체 상호작용 세린/트레오닌 단백질 키나아제 3(RIPK3) 및 그 기질 혼합 계통 키나아제 도메인 유사(MLKL)는 중요한 항바이러스 기능을 가진 염증성 형태의 세포 사멸인 괴사증의 중요한 조절자입니다. RIPK3의 자가인산화는 괴사 MLKL의 기공 형성 실행자 단백질의 인산화 및 활성화를 유도합니다. 세포막에서 인산화된 MLKL의 트래피킹 및 올리고머화는 괴사 세포 사멸의 특징인 세포 용해를 초래합니다. 핵산 센서 ZBP1은 RNA 및 DNA 바이러스에 감염된 후 왼손잡이 Z형 이중가닥 RNA(Z-RNA)에 결합하여 활성화됩니다. ZBP1 활성화는 감염된 숙주 세포의 괴사를 포함한 조절된 세포 사멸을 유도하여 바이러스 감염을 제한합니다. 면역형광 현미경 검사를 사용하면 세포별로 ZBP1 매개 괴사의 다운스트림 다양한 신호 전달 단계를 시각화할 수 있습니다. 그러나 인간 RIPK3 및 MLKL에 대한 현재 상업적으로 이용 가능한 포스포 특이적 항체를 사용하는 표준 형광 현미경의 감도는 이러한 마커의 재현 가능한 이미징을 배제합니다. 여기에서는 단순 포진 바이러스 1(HSV-1)에 감염된 인간 HT-29 세포에서 세린(S) 인산화 RIPK3(S227) 및 MLKL(S358)에 대한 최적화된 염색 절차를 설명합니다. 면역형광 염색 프로토콜에 티라마이드 신호 증폭(TSA) 단계를 포함하면 S227 인산화 RIPK3의 특이적 검출이 가능합니다. 또한 TSA는 S358 인산화 MLKL의 검출 감도를 크게 높입니다. 함께,이 방법은 ZBP1 유발 괴사의 유도 동안이 두 가지 중요한 신호 이벤트의 시각화를 가능하게합니다.

Introduction

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수용체 상호작용 세린/트레오닌 단백질 키나아제 3(RIPK3) 및 혼합 계통 키나아제 도메인 유사(MLKL)는 괴사 세포 사멸 1,2의 중심 조절자입니다. 괴사증은 항 바이러스 면역 및자가 염증에 관여하는 조절 된 세포 사멸의 용질 및 염증성 형태입니다. 바이러스에 감염된 세포의 괴사는 즉시 바이러스 복제를 차단합니다. 괴사 유도 후 세포 용해는 또한 항 바이러스 면역을 자극하는 손상 관련 분자 패턴을 방출합니다 3,4. 괴사증은 3개의 업스트림 활성화 분자 중 하나와의 RIP 동형 상호작용 모티프(RHIM) 매개 상호작용에 따른 RIPK3의 활성화에 의해 시작됩니다: RIPK1 (TNF 수용체 1 [TNFR1] 관여시), TIR 도메인 함유 어댑터 유도 인터페론-β (TRIF; 톨 유사 수용체 3 및 4 결합시) 또는 항바이러스 핵산 센서 Z-DNA 결합 단백질 1 (ZBP1)1,2 . 괴사증 신호 전달은 RIPK3의 자가 인산화로 시작하는 일련의 인산화 이벤트를 통해 진행됩니다....

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Protocol

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1. 비오티닐화 티라마이드의 제조

  1. 비오틴-티라마이드에서 시작하는 비오티닐화 티라마이드를 준비합니다. 10mM 스톡 용액을 만들려면 3.6mg의 비오틴-티라마이드를 1mL의 DMSO에 녹입니다. 용해된 생성물을 품질 보존을 위해 -20°C의 분취량에 보관하십시오.

2. 배양에서 HT-29 세포 유지

참고: ZBP1-발현 HT-29는 인간 ZBP1을 코딩하는 렌티벡터27 을 사용한 형질도입에 의해 생성되었다.

  1. ZBP1 발현 HT-29 세포를 L- 글루타민, 나트륨-피루 베이트 및 10 % 태아 소 혈청이 보충 된 McCoy의 5A 배지 (이제부터는 전체 배지라고 함)에 보관하고 37 ° C의 인큐베이터에서 5 % 이산화탄소로 유지합니다. 이상적으로는 낮은 계대 수 (10 미만)의 셀을 사용하십시오. 실험 시작 전에 해동 주기 후 최소 5일 동안 세포를 회복하도록 두십시오.
  2. 배양 플라스크로부터 세포를 분리하기 위해, 배지를 제거하고, 세포를 5 mL의 PBS(37°C로 예열)로 세척한다. 다음으로, 적절한 양의 트립신/EDTA(각각 ....

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Results

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인간 세포에서 MLKL 인산화 및 특히 RIPK3 인산화의 면역형광 검출은 기술적으로 어렵습니다26. 여기에서는 ZBP1의 활성화시 인간 p-RIPK3 (S227) 및 p-MLKL (S358)에 대한 개선 된 염색 프로토콜을 제시합니다. 상기 프로토콜은 형광 신호의 검출 한계 및 감도를 개선하기 위한 TSA 단계를 포함한다. 상기 방법을 검증하기 위해, TSA 매개 면역형광과 p-RIPK3(S227) 및 p-MLKL(S358) 모두의 표준 간접 형광 염색을 나란히 비교하였다.

인간 ZBP1을 발현하는 HT-29 세포를 ICP6 RHIM 돌연변이 HSV-1 균주(HSV-1 ICP6mutRHIM)로 9시간 동안 감염시켜 ZBP1 매개 괴사 및 RIPK3 인산화를 유도했습니다. HSV-1 ICP6mutRHIM 균주는 ICP6 RHIM 내에서 VQCG에서 AAAA 돌연변이를 운반하며 ZBP1

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Discussion

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이 면역형광 염색 프로토콜은 RIPK3 및 MLKL26의 인산화를 포함하여 검출하기 어려운 인간 괴사 신호 전달 경로의 신호 이벤트에 대한 민감도를 증가시키기 위해 티라마이드 신호 증폭(TSA)의 사용을 설명합니다. TSA 단계를 포함하면 p-RIPK3(S227) 및 p-MLKL(S358)의 검출 임계값이 크게 향상되고 p-MLKL(S358) 변형의 감도가 증가합니다. TSA는 모의 처리된 샘플에 이미 존재하는 p-RIPK3(S227) 신호를 밝혔습니다. 인간 세포에서, S227에서의 RIPK3의 자가인산화는 MLKL과의 안정적인 상호작용을 가능하게 함으로써 괴사증 활성화를 위한 전제 조건이다. 이 과정은 이미 기저 수준에서 발생하며 괴사 유도 2,5,31 이전에 안정적인 비활성 p-RIPK3 (S227) / MLKL 이량 체를 형성합니다........

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Disclosures

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저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgements

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VIB Bioimaging Core의 교육, 지원 및 장비 파크 이용에 감사드립니다. J.N.은 플랑드르 연구 재단 (FWO)의 박사 학위 펠로우십의 지원을 받고 있습니다. JM 그룹의 연구는 Odysseus II Grant (G0H8618N), EOS INFLADIS (40007512), Research Foundation Flanders (FWO)의 주니어 연구 보조금 (G031022N), CRIG 젊은 연구자 개념 증명 보조금 및 겐트 대학의 지원을 받았습니다. P.V. 그룹의 연구는 EOS MODEL-IDI (30826052), EOS INFLADIS (40007512), FWO 선임 연구 보조금 (G.0C76.18N, G.0B71.18N, G.0B96.20N, G.0A9322N), Methusalem (BOF16/MET_V/007), iBOF20/IBF/039 ATLANTIS, Foundation Against Cancer (F/2016/865, F/2020/1505), CRIG 및 GIGG 컨소시엄, VIB의 지원을 받았습니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Antibodies
anti-rabbit HRPAgilent Technologies BelgiumK4002Envision+ System-HRP Labelled Polymer anti-rabbit
Goat anti-mouse DyLight 633Thermofisher35513Secundary 항체
HSV-1 ICP0Santa Cruzsc-53070Mouse anti-ICP0(HSV-1) 항체
IAV-PR8 마우스 혈청자체 생산xx마우스 항-IAV-PR8 폴리클로날 항체
pMLKLAbcamab187091토끼 항-MLKL-phospho S358 항체
pRIPK3Abcamab209384토끼 항-RIPK3-phospho S227 항체
Fluorophores
DAPIThermofisherD21490세포의 핵을 시각화하기 위해
Alexa Fluor 568ThermofisherS11226비오틴 분자를 visulalize하기 위해
Compounds
30% H2O2SigmaH1009HRP 활성에 필요한 산화 기질
4% PFASANBIOAR1068세포를 고정/가교시키기 위하여
Biotinyl-tyramideR& 신호를증폭하기 위해, HRP 기판
BV-6SelleckchemS7597BV6 IAP 억제제
         세포 배양의 경우: 세포를 분리하기 위해
         8.0 g/L 나클
         0.4 g/L EDTA의 이나트륨 염
EDTA 0.04%사내 제형1.1 g/L Na2HPO4
         0.2g/L 나H2PO4
         0.2 g/L 케이클
         0.2 g/L 포도당
소 태아 혈청TICOFBS EU XXX세포 배양, 세포 배양 유지; 로트 번호: 90439
GSK'840AobiousAOB0917 RIPK3 키나아제 억제제
L-글루타민Sigma-AldrichG7513세포 배양, 세포 배양 유지
MAXblockActive Motif15252차단 용액
PBSGibco
나트륨 피루브산시그마-알드리치S8636세포 배양을 위해 세포 배양 TNF
-&알파를 유지합니다.자체 생산-BV6 및 zVAD와 함께 세포 사멸을 유발할 수있는 신호 분자
Triton X-100Sigma AldrichT8787-50ML세포를 투과시키기 위해
Trypan blueMerck11732세포 계수의 경우 0,1 %에서 살아있는 / 죽은 마커로 사용
TrypsineSigma-AldrichT4424세포 배양 : 세포
zVAD분리BachemBACE4026865.0005Z-Val-Ala-DL-Asp-fluoromethylketone
Material
µ-Slide 8 well high glass bottomiBidi80807세포를 배양하기 위해
Cotton Preping Balls-size mediumElectron Microscopy Sciences71001-10대물렌즈를 청소하려면
Immersol 518 F / 30 ° CZEISS444970-9000-000고배율에서 샘플을 시각화하기 위해
렌즈 클리너ZEISS000000-0105-200대물렌즈를 청소하려면
LSM880 Fast Airyscan 컨포칼 현미경샘플을 시각화하기 위해
Software
ExcelOfficexx데이터를 처리하려면
Prism 9Graphpadxx데이터 분석 - 통계 테스트 및 그래프 생성
Volocity 6.3Volocityxx정량화 수행
Zen blackZEISSxx이미지 수집 및 처리 Zen
blueZEISSxx이미지 시각화
Viruses
HSV-1 (mutRHIM) F 균주  Jiahuai Han 박사가 생산HSV-1부사 분폐증의 방아쇠로 사용됩니다. UL39/ICP6의 RHIM 코어 도메인은 돌연변이(VQCG>AAAA)
HSV-1(WT) F 균주Jiahuai Han 박사가 사내 복제에서HSV-1(WT)은 괴사 유도(ICP6 억제)에 대한 음성 대조군으로,
IAV PR8사내 복제에서IAV를 괴사화의 방아쇠
10444402 한 은 생산한 은 로 사용합니다.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Meng, Y., Sandow, J. J., Czabotar, P. E., Murphy, J. M. The regulation of necroptosis by post-translational modifications. Cell Death & Differentiation. 28 (3), 861-883 (2021).
  2. Petrie, E. J., Czabotar, P. E., Murphy, J. M. The structural basis of necroptotic c....

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Tyramide Signal AmplificationImmunofluorescent StainingZBP1 Dependent NecroptosisPhosphorylated RIPK3Phosphorylated MLKLHSV 1 InfectionConfocal MicroscopyNecroptosis BiomarkersCell Death PathwaysHuman HT 29 Cells

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