인간 세포에서 HSV-1 감염 후 RIPK3 및 MLKL의 ZBP1 의존성 인산화의 면역형광염색을 위한 티라마이드 신호 증폭
Summary
면역형광 염색 중 티라마이드 신호 증폭은 HSV-1 감염 후 ZBP1 유발 괴사 동안 인산화된 RIPK3 및 MLKL의 민감한 검출을 가능하게 합니다.
Abstract
키나아제 수용체 상호작용 세린/트레오닌 단백질 키나아제 3(RIPK3) 및 그 기질 혼합 계통 키나아제 도메인 유사(MLKL)는 중요한 항바이러스 기능을 가진 염증성 형태의 세포 사멸인 괴사증의 중요한 조절자입니다. RIPK3의 자가인산화는 괴사 MLKL의 기공 형성 실행자 단백질의 인산화 및 활성화를 유도합니다. 세포막에서 인산화된 MLKL의 트래피킹 및 올리고머화는 괴사 세포 사멸의 특징인 세포 용해를 초래합니다. 핵산 센서 ZBP1은 RNA 및 DNA 바이러스에 감염된 후 왼손잡이 Z형 이중가닥 RNA(Z-RNA)에 결합하여 활성화됩니다. ZBP1 활성화는 감염된 숙주 세포의 괴사를 포함한 조절된 세포 사멸을 유도하여 바이러스 감염을 제한합니다. 면역형광 현미경 검사를 사용하면 세포별로 ZBP1 매개 괴사의 다운스트림 다양한 신호 전달 단계를 시각화할 수 있습니다. 그러나 인간 RIPK3 및 MLKL에 대한 현재 상업적으로 이용 가능한 포스포 특이적 항체를 사용하는 표준 형광 현미경의 감도는 이러한 마커의 재현 가능한 이미징을 배제합니다. 여기에서는 단순 포진 바이러스 1(HSV-1)에 감염된 인간 HT-29 세포에서 세린(S) 인산화 RIPK3(S227) 및 MLKL(S358)에 대한 최적화된 염색 절차를 설명합니다. 면역형광 염색 프로토콜에 티라마이드 신호 증폭(TSA) 단계를 포함하면 S227 인산화 RIPK3의 특이적 검출이 가능합니다. 또한 TSA는 S358 인산화 MLKL의 검출 감도를 크게 높입니다. 함께,이 방법은 ZBP1 유발 괴사의 유도 동안이 두 가지 중요한 신호 이벤트의 시각화를 가능하게합니다.
Introduction
수용체 상호작용 세린/트레오닌 단백질 키나아제 3(RIPK3) 및 혼합 계통 키나아제 도메인 유사(MLKL)는 괴사 세포 사멸 1,2의 중심 조절자입니다. 괴사증은 항 바이러스 면역 및자가 염증에 관여하는 조절 된 세포 사멸의 용질 및 염증성 형태입니다. 바이러스에 감염된 세포의 괴사는 즉시 바이러스 복제를 차단합니다. 괴사 유도 후 세포 용해는 또한 항 바이러스 면역을 자극하는 손상 관련 분자 패턴을 방출합니다 3,4. 괴사증은 3개의 업스트림 활성화 분자 중 하나와의 RIP 동형 상호작용 모티프(RHIM) 매개 상호작용에 따른 RIPK3의 활성화에 의해 시작됩니다: RIPK1 (TNF 수용체 1 [TNFR1] 관여시), TIR 도메인 함유 어댑터 유도 인터페론-β (TRIF; 톨 유사 수용체 3 및 4 결합시) 또는 항바이러스 핵산 센서 Z-DNA 결합 단백질 1 (ZBP1)1,2 . 괴사증 신호 전달은 RIPK3의 자가 인산화로 시작하는 일련의 인산화 이벤트를 통해 진행됩니다. 키나아제 도메인 내부의 세린 (S) 227에서 인간 RIPK3의 자가 인산화는 MLKL과의 상호 작용을 가능하게함으로써 괴사를위한 전제 조건이며 일반적으로 인간 RIPK3 활성화 및 괴사 세포 사멸 1,5에 대한 생화학 적 마커로 사용됩니다. 일단 활성화되면, RIPK3는 트레오닌 (T)357 및 S3581에서 MLKL의 활성화 루프를 인산화한다. 이로 인해 MLKL 형태가 변경되어 N 단자 4 개의 나선 번들 도메인이 노출됩니다. 그런 다음 MLKL은 올리고머화되어 세포막으로 이동하여 지질 이중층에 노출된 4개의 나선 다발을 삽입하여 기공을 형성하여 결국 세포 사멸을 초래합니다 2,6.
ZBP1은 Z-형태(Z-RNA)에 이중 가닥 RNA를 포함하여 왼손잡이 Z형 핵산을 인식하는 항바이러스 핵산 센서입니다. Z-RNA 결합은 ZBP1의 N-말단에 위치한 두 개의 Zα-도메인을 통해 발생합니다. RNA 및 DNA 바이러스 감염 동안 축적되는 Z-RNA는 ZBP1 7,8과 직접 관여하는 것으로 생각된다. 활성화 된 ZBP1은 중앙 RHIM을 통해 RIPK3를 모집하고 괴사 9,10을 포함하여 조절 된 세포 사멸을 유도합니다. 바이러스는 ZBP1 유도 숙주 세포 괴사11에 대응하기 위해 수많은 탈출 메커니즘을 채택했습니다. 예를 들어, ICP6으로 알려져 있고 UL39에 의해 코딩되는 단순 포진 바이러스 1 (HSV-1) 리보 뉴클레오티드 환원 효소 서브 유닛 1은 인간 세포12,13,14,15에서 ZBP1 매개 RIPK3 활성화를 방해하는 N- 말단에 RHIM을 보유한다. ZBP1은 바이러스 복제를 제한 할뿐만 아니라 마우스 연구에 따르면 ZBP1 활성화는 염증성 질환을 유발하고 암 면역16,17,18,19,20,21을 자극합니다. 따라서 인간 세포에서 ZBP1 유발 괴사 중에 발생하는 신호 이벤트를 감지하는 프로토콜은 이러한 과정에서 ZBP1의 역할을 평가하는 데 중요합니다.
촉매 리포터 증착(CARD)이라고도 하는 티라마이드 신호 증폭(TSA)은 항체 기반 면역 분석에서 검출 한계 및 신호 대 잡음비를 개선하기 위해 개발되었습니다. TSA 동안, 임의의 1차 항체가 관심있는 항원을 검출하는데 사용될 수 있다. 2차 항체에 결합된 고추냉이 과산화효소(HRP)는 과산화수소의 존재 하에 비오티닐화된 티라마이드 라디칼의 국소 축적을 촉매합니다. 이러한 활성화 된 비오틴-티라마이드 라디칼은 근위 티로신 잔기와 반응하여 공유 결합을 형성합니다. 잠재적인 티라미드-비오틴 기질은 항원 자체, 1차 및 2차 항체, 및 이웃 단백질을 포함한다. 따라서 TSA는 분석의 감도를 크게 향상시키지만 공간 분해능의 일부가 손실됩니다. 마지막 단계에서 비오틴 분자는 형광 표지된 스트렙타비딘을 사용하여 검출됩니다. HRP 반응은 관심 항원 위 또는 그 근처에 많은 티라마이드-비오틴 분자를 침착시킵니다. 이것은 스트렙타비딘-플루오로크롬 결합 부위의 수를 크게 증가시켜 분석의 감도를 크게 증폭시킵니다(그림 1). 대안적으로, 티라마이드는 형광 색소에 직접 결합될 수 있어 스트렙타비딘 결합 형광단의 필요성을 제거합니다. 단백질 면역 조직 화학 및 DNA / RNA 현장 혼성화는 TSA가 신호 강도를 개선하기 위해 사용 된 최초의 방법 중 하나였습니다22,23. 보다 최근에, TSA는 세포내 유세포분석법(24) 및 질량분석법(25)과 결합되었다.
여기에서는 면역형광현미경을 이용하여 HSV-1 감염에 의한 ZBP1의 활성화시 인산화된 인간 RIPK3(p-RIPK3[S227]) 및 인산화된 인간 MLKL(p-MLKL[S358])을 검출하는 프로토콜을 제시한다. 우리는 인간 ZBP1을 안정적으로 발현하도록 형질도입된 괴사에 민감한 HT-29 인간 결장직장 선암 세포주를 사용합니다. 이 세포들은 바이러스 RHIM (VQCG) 내의 4 개의 핵심 아미노산이 알라닌 (AAAA)으로 대체 된 돌연변이 ICP6 단백질 (HSV-1 ICP6mutRHIM)을 발현하는 HSV-1 균주에 감염되어 ICP6가 ZBP1 매개 괴사13,14,15를 차단할 수 없게되었습니다. 면역염색26에서 p-RIPK3 및 p-MLKL에 대한 현재 상용화된 항체의 낮은 신호 대 잡음비 문제를 극복하기 위해 티라마이드 신호 증폭(TSA) 단계(그림 1)를 수행하여 인간 p-RIPK3의 강력한 검출(S227)을 달성하고 인간 p-MLKL의 검출 감도를 한 단계 향상시킵니다(S358).
Protocol
Representative Results
Discussion
이 면역형광 염색 프로토콜은 RIPK3 및 MLKL26의 인산화를 포함하여 검출하기 어려운 인간 괴사 신호 전달 경로의 신호 이벤트에 대한 민감도를 증가시키기 위해 티라마이드 신호 증폭(TSA)의 사용을 설명합니다. TSA 단계를 포함하면 p-RIPK3(S227) 및 p-MLKL(S358)의 검출 임계값이 크게 향상되고 p-MLKL(S358) 변형의 감도가 증가합니다. TSA는 모의 처리된 샘플에 이미 존재하는 p-RIPK3(S227) 신호?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
VIB Bioimaging Core의 교육, 지원 및 장비 파크 이용에 감사드립니다. J.N.은 플랑드르 연구 재단 (FWO)의 박사 학위 펠로우십의 지원을 받고 있습니다. JM 그룹의 연구는 Odysseus II Grant (G0H8618N), EOS INFLADIS (40007512), Research Foundation Flanders (FWO)의 주니어 연구 보조금 (G031022N), CRIG 젊은 연구자 개념 증명 보조금 및 겐트 대학의 지원을 받았습니다. P.V. 그룹의 연구는 EOS MODEL-IDI (30826052), EOS INFLADIS (40007512), FWO 선임 연구 보조금 (G.0C76.18N, G.0B71.18N, G.0B96.20N, G.0A9322N), Methusalem (BOF16/MET_V/007), iBOF20/IBF/039 ATLANTIS, Foundation Against Cancer (F/2016/865, F/2020/1505), CRIG 및 GIGG 컨소시엄, VIB의 지원을 받았습니다.
Materials
| Antibodies | |||
| Anti-rabbit HRP | Agilent Technologies Belgium | K4002 | Envision+ System-HRP Labelled Polymer anti-rabbit |
| Goat anti-mouse DyLight 633 | Thermofisher | 35513 | Secundary antibody |
| HSV-1 ICP0 | Santa Cruz | sc-53070 | Mouse anti-ICP0(HSV-1) antibody |
| IAV-PR8 mouse serum | In house production | xx | Mouse anti-IAV-PR8 polyclonal antibody |
| pMLKL | Abcam | ab187091 | Rabbit anti-MLKL-phospho S358 antibody |
| pRIPK3 | Abcam | ab209384 | Rabbit anti-RIPK3-phospho S227 antibody |
| Fluorophores | |||
| DAPI | Thermofisher | D21490 | To visualise the nucleus of the cells |
| Streptavidin coupled to Alexa Fluor 568 | Thermofisher | S11226 | To visulalise biotin molecules |
| Compounds | |||
| 30% H2O2 | Sigma | H1009 | Oxidising substrate, necessary for HRP activity |
| 4% PFA | SANBIO | AR1068 | To fix/crosslink the cells |
| Biotinyl-tyramide | R&D Systems | 6241 | To amplify signal, HRP substrate |
| BV-6 | Selleckchem | S7597 | BV6 IAP Inhibitor |
| For cell culture: to detach the cells | |||
| 8.0 g/L NaCl | |||
| 0.4 g/L disodium salt of EDTA | |||
| EDTA 0.04% | In house formulation | 1.1 g/L Na2HPO4 | |
| 0.2 g/L NaH2PO4 | |||
| 0.2 g/L KCl | |||
| 0.2 g/L Glucose | |||
| Fetal Bovine serum | TICO | FBS EU XXX | For cell culture, maintaining cell culture; lot number: 90439 |
| GSK'840 | Aobious | AOB0917 | RIPK3 kinase inhibitor |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | For cell culture, maintaining cell culture |
| MAXblock | Active Motif | 15252 | Blocking solution |
| PBS | Gibco | 10444402 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | For cell culture, maintaining cell culture |
| TNF-α | In house production | – | Signaling molecule, able to trigger cell death in combination with BV6 and zVAD |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787-50ML | To permeabilise the cells |
| Trypan blue | Merck | 11732 | For cell counting, used as live/dead marker at 0,1% |
| Trypsine | Sigma-Aldrich | T4424 | For cell culture: to detach the cells |
| zVAD | Bachem | BACE4026865.0005 | Z-Val-Ala-DL-Asp-fluoromethylketone |
| Material | |||
| µ-Slide 8 well high glass bottom | iBidi | 80807 | To culture the cells |
| Cotton Preping Balls-size medium | Electron Microscopy Sciences | 71001-10 | To clean the objectives |
| Immersol 518 F / 30 °C | ZEISS | 444970-9000-000 | To visualise the sample at high magnifications |
| Lens Cleaner | ZEISS | 000000-0105-200 | To clean the objectives |
| LSM880 Fast Airyscan confocal microscope | To visualise the sample | ||
| Software | |||
| Excel | Office | xx | To process the data |
| Prism 9 | Graphpad | xx | To analyse the data- statistical testing and graph generation |
| Volocity 6.3 | Volocity | xx | To perform quantifications |
| Zen black | ZEISS | xx | To aquire and process images |
| Zen blue | ZEISS | xx | To visualise images |
| Viruses | |||
| HSV-1 (mutRHIM) F strain | produced by Dr. Jiahuai Han | in house replication | HSV-1 as a trigger for necroptosis; RHIM core domain of UL39/ICP6 is mutated (VQCG>AAAA) |
| HSV-1 (WT) F strain | Produced by Dr. Jiahuai Han | in house replication | HSV-1 (WT) as a negative control for necroptosis induction (ICP6 inhibition) |
| IAV PR8 | in house stock | in house replication | IAV as a trigger for necroptosis |
References
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