Усиление тирамидного сигнала для иммунофлуоресцентного окрашивания ZBP1-зависимого фосфорилирования RIPK3 и MLKL после инфекции HSV-1 в клетках человека
Summary
Усиление тирамидного сигнала во время иммунофлуоресцентного окрашивания позволяет чувствительно обнаруживать фосфорилированные RIPK3 и MLKL во время ZBP1-индуцированного некроптоза после инфекции ВПГ-1.
Abstract
Киназна-взаимодействующая с рецептором серин/треонин протеинкиназа 3 (RIPK3) и ее субстрат смешанной линии киназы доменной (MLKL) являются критическими регуляторами некроптоза, воспалительной формы гибели клеток с важными противовирусными функциями. Аутофосфорилирование RIPK3 индуцирует фосфорилирование и активацию порообразующего белка-палача некроптоза MLKL. Незаконный оборот и олигомеризация фосфорилированного МЛКЛ на клеточной мембране приводит к лизису клеток, характерному для некроптотической гибели клеток. Датчик нуклеиновых кислот ZBP1 активируется путем связывания с левосторонней Z-формой двухцепочечной РНК (Z-РНК) после заражения РНК и ДНК-вирусами. Активация ZBP1 ограничивает вирусную инфекцию, вызывая регулируемую гибель клеток, включая некроптоз, инфицированных клеток-хозяев. Иммунофлуоресцентная микроскопия позволяет визуализировать различные сигнальные стадии после ZBP1-опосредованного некроптоза на клеточной основе. Однако чувствительность стандартной флуоресцентной микроскопии с использованием современных коммерчески доступных фосфоспецифических антител против человека RIPK3 и MLKL исключает воспроизводимую визуализацию этих маркеров. Здесь мы описываем оптимизированную процедуру окрашивания сериновых (S) фосфорилированных RIPK3 (S227) и MLKL (S358) в клетках HT-29 человека, инфицированных вирусом простого герпеса 1 (HSV-1). Включение стадии усиления тирамидного сигнала (TSA) в протокол иммунофлуоресцентного окрашивания позволяет специфически обнаруживать фосфорилированный RIPK3 S227. Кроме того, TSA значительно повышает чувствительность обнаружения фосфорилированного MLKL S358. Вместе этот метод позволяет визуализировать эти два критических сигнальных события во время индукции некроптоза, индуцированного ZBP1.
Introduction
Рецептор-взаимодействующая серин/треонин протеинкиназа 3 (RIPK3) и доменная диназа смешанной линии (MLKL) являются центральными регуляторами некроптотической гибели клеток 1,2. Некроптоз является литической и воспалительной формой регулируемой гибели клеток, участвующей в противовирусном иммунитете и аутовоспалении. Некроптоз инфицированных вирусом клеток немедленно отключает репликацию вируса. Лизис клеток после индукции некроптоза также высвобождает связанные с повреждением молекулярные паттерны, которые стимулируют противовирусный иммунитет 3,4. Некроптоз инициируется активацией RIPK3 после опосредованного мотивом гомотипического взаимодействия RIP (RHIM) с одной из трех восходящих активирующих молекул: RIPK1 (при вовлечении рецептора TNF 1 [TNFR1]), TIR-доменсодержащим адаптером, индуцирующим интерферон-β (TRIF; при вовлечении Toll-подобных рецепторов 3 и 4) или датчиком противовирусной нуклеиновой кислоты Z-ДНК-связывающим белком 1 (ZBP1)1,2 . Передача сигналов некроптоза протекает через серию событий фосфорилирования, начиная с автофосфорилирования RIPK3. Аутофосфорилирование человеческого RIPK3 при серине (S)227 внутри его киназного домена является предпосылкой для некроптоза, обеспечивая взаимодействие с MLKL, и обычно используется в качестве биохимического маркера активации RIPK3 человека и некроптотической гибели клеток 1,5. После активации RIPK3 фосфорилирует цикл активации MLKL при треонине (T)357 и S3581. Это вызывает изменение конформации MLKL, что приводит к воздействию N-концевого домена четырехспирального пучка спирали. Затем MLKL олигомеризуется и транспортируется к клеточной мембране, где он образует пору через вставку открытых четырех пучков спирали в липидный бислой, что в конечном итоге приводит к гибели клеток 2,6.
ZBP1 – это датчик противовирусных нуклеиновых кислот, который распознает левосторонние Z-образные нуклеиновые кислоты, включая двухцепочечную РНК в Z-конформации (Z-РНК). Связывание Z-РНК происходит через два Zα-домена, расположенных на N-конце ZBP1. Считается, что Z-РНК, накапливающаяся во время заражения РНК и ДНК вирусами, напрямую влияет на ZBP1 7,8. Активированный ZBP1 набирает RIPK3 через свои центральные RHIM и индуцирует регулируемую гибель клеток, включая некроптоз 9,10. Вирусы приняли многочисленные механизмы побега для противодействия ZBP1-индуцированному некроптозу клеток-хозяев11. Например, вирус простого герпеса 1 (ВПГ-1) рибонуклеотидредуктазы субъединицы 1, известный как ICP6 и кодируемый UL39, содержит RHIM на своем N-конце, который препятствует ZBP1-опосредованной активации RIPK3 в клетках человека 12,13,14,15. ZBP1 не только ограничивает репликацию вируса, но исследования на мышах показали, что активация ZBP1 вызывает воспалительные заболевания и стимулирует раковый иммунитет 16,17,18,19,20,21. Поэтому протоколы, которые обнаруживают сигнальные события, происходящие во время ZBP1-индуцированного некроптоза в клетках человека, ценны для оценки роли ZBP1 в этих процессах.
Амплификация тирамидного сигнала (TSA), также называемая катализируемым репортерным осаждением (CARD), была разработана для улучшения предела обнаружения и отношения сигнал/шум в иммуноанализах на основе антител. Во время TSA любое первичное антитело может быть использовано для обнаружения интересующего антигена. Пероксидаза хрена (HRP) в сочетании со вторичным антителом катализирует местное накопление биотинилированных тирамидных радикалов в присутствии перекиси водорода. Эти активированные биотин-тирамидные радикалы затем реагируют с проксимальными остатками тирозина с образованием ковалентных связей. Потенциальные тирамидно-биотиновые субстраты включают сам антиген, первичные и вторичные антитела и соседние белки. Таким образом, в то время как TSA значительно улучшает чувствительность анализа, часть его пространственного разрешения теряется. На заключительном этапе молекулы биотина обнаруживаются с использованием флуоресцентно меченого стрептавидина. Реакция HRP откладывает много молекул тирамида-биотина на интересующем антигене или рядом с ним. Это значительно увеличивает количество сайтов связывания стрептавидин-фторхром, тем самым значительно усиливая чувствительность анализа (рисунок 1). Альтернативно, тирамид может быть непосредственно соединен с фторхромом, устраняя необходимость в флуорофорах, связанных со стрептавидином. Иммуногистохимия белка и гибридизация ДНК/РНК in situ были одними из первых методов, с помощью которых TSA был использован для улучшения интенсивности сигнала22,23. Совсем недавно TSA был объединен с внутриклеточной проточной цитометрией24 и масс-спектрометрией25.
Здесь мы представляем протокол для обнаружения серина 227 фосфорилированного человеческого RIPK3 (p-RIPK3 [S227]) и фосфорилированного человеческого MLKL (p-MLKL [S358]) при активации ZBP1 инфекцией HSV-1 с использованием иммунофлуоресцентной микроскопии. Мы используем чувствительную к некроптозу клеточную линию колоректальной аденокарциномы человека HT-29, которая была трансдуцирована для стабильной экспрессии человеческого ZBP1. Эти клетки были инфицированы штаммом HSV-1, экспрессирующим мутантный белок ICP6 (HSV-1 ICP6mutRHIM), в котором четыре основные аминокислоты в вирусном RHIM (VQCG) были заменены аланинами (AAAA), тем самым делая ICP6 неспособным блокировать ZBP1-опосредованный некроптоз 13,14,15. Чтобы преодолеть проблему низкого отношения сигнал/шум коммерчески доступных в настоящее время антител, направленных против p-RIPK3 и p-MLKL в иммуноокрашивании26, мы выполняем стадию усиления тирамидного сигнала (TSA) (рисунок 1), которая приводит к надежному обнаружению человеческого p-RIPK3 (S227) и улучшает чувствительность обнаружения p-MLKL человека (S358) на порядок.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол иммунофлуоресцентного окрашивания описывает использование амплификации тирамидного сигнала (TSA) для повышения чувствительности к сигнальным событиям некроптотического сигнального пути человека, которые трудно обнаружить, включая фосфорилирование RIPK3 и MLKL26</s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить VIB Bioimaging Core за обучение, поддержку и доступ к инструментальному парку. J.N. поддерживается стипендией PhD от Исследовательского фонда Фландрии (FWO). Исследования в группе J.M. были поддержаны грантом Odysseus II (G0H8618N), EOS INFLADIS (40007512), грантом для младших исследователей (G031022N) от Исследовательского фонда Фландрии (FWO), грантом CRIG для молодых исследователей, доказательством концепции, а также Гентским университетом. Исследования в группе P.V. были поддержаны EOS MODEL-IDI (30826052), EOS INFLADIS (40007512), старшими исследовательскими грантами FWO (G.0C76.18N, G.0B71.18N, G.0B96.20N, G.0A9322N), Methusalem (BOF16/MET_V/007), iBOF20/IBF/039 ATLANTIS, Фондом против рака (F/2016/865, F/2020/1505), консорциумами CRIG и GIGG и VIB.
Materials
| Antibodies | |||
| Anti-rabbit HRP | Agilent Technologies Belgium | K4002 | Envision+ System-HRP Labelled Polymer anti-rabbit |
| Goat anti-mouse DyLight 633 | Thermofisher | 35513 | Secundary antibody |
| HSV-1 ICP0 | Santa Cruz | sc-53070 | Mouse anti-ICP0(HSV-1) antibody |
| IAV-PR8 mouse serum | In house production | xx | Mouse anti-IAV-PR8 polyclonal antibody |
| pMLKL | Abcam | ab187091 | Rabbit anti-MLKL-phospho S358 antibody |
| pRIPK3 | Abcam | ab209384 | Rabbit anti-RIPK3-phospho S227 antibody |
| Fluorophores | |||
| DAPI | Thermofisher | D21490 | To visualise the nucleus of the cells |
| Streptavidin coupled to Alexa Fluor 568 | Thermofisher | S11226 | To visulalise biotin molecules |
| Compounds | |||
| 30% H2O2 | Sigma | H1009 | Oxidising substrate, necessary for HRP activity |
| 4% PFA | SANBIO | AR1068 | To fix/crosslink the cells |
| Biotinyl-tyramide | R&D Systems | 6241 | To amplify signal, HRP substrate |
| BV-6 | Selleckchem | S7597 | BV6 IAP Inhibitor |
| For cell culture: to detach the cells | |||
| 8.0 g/L NaCl | |||
| 0.4 g/L disodium salt of EDTA | |||
| EDTA 0.04% | In house formulation | 1.1 g/L Na2HPO4 | |
| 0.2 g/L NaH2PO4 | |||
| 0.2 g/L KCl | |||
| 0.2 g/L Glucose | |||
| Fetal Bovine serum | TICO | FBS EU XXX | For cell culture, maintaining cell culture; lot number: 90439 |
| GSK'840 | Aobious | AOB0917 | RIPK3 kinase inhibitor |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | For cell culture, maintaining cell culture |
| MAXblock | Active Motif | 15252 | Blocking solution |
| PBS | Gibco | 10444402 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | For cell culture, maintaining cell culture |
| TNF-α | In house production | – | Signaling molecule, able to trigger cell death in combination with BV6 and zVAD |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787-50ML | To permeabilise the cells |
| Trypan blue | Merck | 11732 | For cell counting, used as live/dead marker at 0,1% |
| Trypsine | Sigma-Aldrich | T4424 | For cell culture: to detach the cells |
| zVAD | Bachem | BACE4026865.0005 | Z-Val-Ala-DL-Asp-fluoromethylketone |
| Material | |||
| µ-Slide 8 well high glass bottom | iBidi | 80807 | To culture the cells |
| Cotton Preping Balls-size medium | Electron Microscopy Sciences | 71001-10 | To clean the objectives |
| Immersol 518 F / 30 °C | ZEISS | 444970-9000-000 | To visualise the sample at high magnifications |
| Lens Cleaner | ZEISS | 000000-0105-200 | To clean the objectives |
| LSM880 Fast Airyscan confocal microscope | To visualise the sample | ||
| Software | |||
| Excel | Office | xx | To process the data |
| Prism 9 | Graphpad | xx | To analyse the data- statistical testing and graph generation |
| Volocity 6.3 | Volocity | xx | To perform quantifications |
| Zen black | ZEISS | xx | To aquire and process images |
| Zen blue | ZEISS | xx | To visualise images |
| Viruses | |||
| HSV-1 (mutRHIM) F strain | produced by Dr. Jiahuai Han | in house replication | HSV-1 as a trigger for necroptosis; RHIM core domain of UL39/ICP6 is mutated (VQCG>AAAA) |
| HSV-1 (WT) F strain | Produced by Dr. Jiahuai Han | in house replication | HSV-1 (WT) as a negative control for necroptosis induction (ICP6 inhibition) |
| IAV PR8 | in house stock | in house replication | IAV as a trigger for necroptosis |
References
- Meng, Y., Sandow, J. J., Czabotar, P. E., Murphy, J. M. The regulation of necroptosis by post-translational modifications. Cell Death & Differentiation. 28 (3), 861-883 (2021).
- Petrie, E. J., Czabotar, P. E., Murphy, J. M. The structural basis of necroptotic cell death signaling. Trends in Biochemical Sciences. 44 (1), 53-63 (2019).
- Mocarski, E. S., Guo, H., Kaiser, W. J. Necroptosis: The Trojan horse in cell autonomous antiviral host defense. Virology. 479-480, 160-166 (2015).
- Nailwal, H., Chan, F. K. Necroptosis in anti-viral inflammation. Cell Death & Differentiation. 26 (1), 4-13 (2019).
- Meng, Y., et al. Human RIPK3 maintains MLKL in an inactive conformation prior to cell death by necroptosis. Nature Communications. 12 (1), 6783 (2021).
- Samson, A. L., Garnish, S. E., Hildebrand, J. M., Murphy, J. M. Location, location, location: A compartmentalized view of TNF-induced necroptotic signaling. Science Signalling. 14 (668), (2021).
- Koehler, H., et al. Vaccinia virus E3 prevents sensing of Z-RNA to block ZBP1-dependent necroptosis. Cell Host Microbe. 29 (8), 1266-1276 (2021).
- Balachandran, S., Mocarski, E. S. Viral Z-RNA triggers ZBP1-dependent cell death. Current Opinion in Virology. 51, 134-140 (2021).
- Kuriakose, T., Kanneganti, T. D. ZBP1: Innate sensor regulating cell death and inflammation. Trends in Immunology. 39 (2), 123-134 (2018).
- Maelfait, J., Liverpool, L., Rehwinkel, J. Nucleic acid sensors and programmed cell death. Journal of Molecular Biology. 432 (2), 552-568 (2020).
- Verdonck, S., Nemegeer, J., Vandenabeele, P., Maelfait, J. Viral manipulation of host cell necroptosis and pyroptosis. Trends in Microbiology. 30 (6), 593-605 (2022).
- Guo, H., et al. Herpes simplex virus suppresses necroptosis in human cells. Cell Host & Microbe. 17 (2), 243-251 (2015).
- Yu, X., et al. Herpes simplex virus 1 (HSV-1) and HSV-2 mediate species-specific modulations of programmed necrosis through the viral ribonucleotide reductase large subunit R1. Journal of Virology. 90 (2), 1088-1095 (2016).
- Huang, Z., et al. RIP1/RIP3 binding to HSV-1 ICP6 initiates necroptosis to restrict virus propagation in mice. Cell Host & Microbe. 17 (2), 229-242 (2015).
- Guo, H., et al. Species-independent contribution of ZBP1/DAI/DLM-1-triggered necroptosis in host defense against HSV1. Cell Death & Disease. 9 (8), 816 (2018).
- Devos, M., et al. Sensing of endogenous nucleic acids by ZBP1 induces keratinocyte necroptosis and skin inflammation. The Journal of Experimental Medicine. 217 (7), 20191913 (2020).
- Jiao, H., et al. Z-nucleic-acid sensing triggers ZBP1-dependent necroptosis and inflammation. Nature. 580 (7803), 391-395 (2020).
- de Reuver, R., et al. ADAR1 prevents autoinflammation by suppressing spontaneous ZBP1 activation. Nature. 607 (7920), 784-789 (2022).
- Jiao, H., et al. ADAR1 averts fatal type I interferon induction by ZBP1. Nature. 607 (7920), 776-783 (2022).
- Hubbard, N. W., et al. ADAR1 mutation causes ZBP1-dependent immunopathology. Nature. 607 (7920), 769-775 (2022).
- Zhang, T., et al. ADAR1 masks the cancer immunotherapeutic promise of ZBP1-driven necroptosis. Nature. 606 (7914), 594-602 (2022).
- Adams, J. C. Biotin amplification of biotin and horseradish peroxidase signals in histochemical stains. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 40 (10), 1457-1463 (1992).
- Speel, E. J., Hopman, A. H., Komminoth, P. Tyramide signal amplification for DNA and mRNA in situ hybridization. Methods in Molecular Biology. 326, 33-60 (2006).
- Clutter, M. R., Heffner, G. C., Krutzik, P. O., Sachen, K. L., Nolan, G. P. Tyramide signal amplification for analysis of kinase activity by intracellular flow cytometry. Cytometry A. 77 (11), 1020-1031 (2010).
- Dopie, J., Sweredoski, M. J., Moradian, A., Belmont, A. S. Tyramide signal amplification mass spectrometry (TSA-MS) ratio identifies nuclear speckle proteins. The Journal of Cell Biology. 219 (9), 201910207 (2020).
- Samson, A. L., et al. A toolbox for imaging RIPK1, RIPK3, and MLKL in mouse and human cells. Cell Death and Differentiation. 28 (7), 2126-2144 (2021).
- De Groote, P., et al. Generation of a new gateway-compatible inducible lentiviral vector platform allowing easy derivation of co-transduced cells. Biotechniques. 60 (5), 252-259 (2016).
- Ali, M., Roback, L., Mocarski, E. S. Herpes simplex virus 1 ICP6 impedes TNF receptor 1-induced necrosome assembly during compartmentalization to detergent-resistant membrane vesicles. The Journal of Biological Chemistry. 294 (3), 991-1004 (2019).
- Mandal, P., et al. RIP3 induces apoptosis independent of pronecrotic kinase activity. Moleular Cell. 56 (4), 481-495 (2014).
- Zhang, T., et al. Influenza virus Z-RNAs induce ZBP1-mediated necroptosis. Cell. 180 (6), 1115-1129 (2020).
- Garnish, S. E., et al. Conformational interconversion of MLKL and disengagement from RIPK3 precede cell death by necroptosis. Nature Communications. 12 (1), 2211 (2021).
- Clay, H., Ramakrishnan, L. Multiplex fluorescent in situ hybridization in zebrafish embryos using tyramide signal amplification. Zebrafish. 2 (2), 105-111 (2005).
- Parra, E. R., et al. Procedural requirements and recommendations for multiplex immunofluorescence tyramide signal amplification assays to support translational oncology studies. Cancers. 12 (2), 255 (2020).
