Amplificación de la señal de tiramida para la tinción inmunofluorescente de la fosforilación dependiente de ZBP1 de RIPK3 y MLKL después de la infección por HSV-1 en células humanas
Summary
La amplificación de la señal de tiramida durante la tinción inmunofluorescente permite la detección sensible de RIPK3 y MLKL fosforilados durante la necroptosis inducida por ZBP1 después de la infección por HSV-1.
Abstract
La quinasa Receptor-interacción serina/treonina proteína quinasa 3 (RIPK3) y su sustrato mixto de linaje quinasa similar a dominio (MLKL) son reguladores críticos de necroptosis, una forma inflamatoria de muerte celular con importantes funciones antivirales. La autofosforilación de RIPK3 induce la fosforilación y activación de la proteína verdugo formadora de poros de la necroptosis MLKL. El tráfico y oligomerización de MLKL fosforilada en la membrana celular da lugar a la lisis celular, característica de la muerte celular necroptótica. El sensor de ácido nucleico ZBP1 se activa uniéndose al ARN bicatenario zurdo en forma Z (ARN-Z) después de la infección con virus de ARN y ADN. La activación de ZBP1 restringe la infección por virus al inducir la muerte celular regulada, incluida la necroptosis, de las células huésped infectadas. La microscopía de inmunofluorescencia permite la visualización de diferentes pasos de señalización aguas abajo de la necroptosis mediada por ZBP1 por célula. Sin embargo, la sensibilidad de la microscopía de fluorescencia estándar, utilizando anticuerpos fosfoespecíficos disponibles comercialmente contra RIPK3 y MLKL humanos, impide la obtención de imágenes reproducibles de estos marcadores. Aquí, describimos un procedimiento de tinción optimizado para serina (S) fosforiladas RIPK3 (S227) y MLKL (S358) en células humanas HT-29 infectadas con el virus del herpes simple 1 (HSV-1). La inclusión de un paso de amplificación de señal de tiramida (TSA) en el protocolo de tinción inmunofluorescente permite la detección específica de S227 fosforilado RIPK3. Además, TSA aumenta en gran medida la sensibilidad de la detección de MLKL fosforilado S358. Juntos, este método permite la visualización de estos dos eventos críticos de señalización durante la inducción de la necroptosis inducida por ZBP1.
Introduction
La proteína quinasa 3 de serina/treonina que interactúa con receptores (RIPK3) y la quinasa de linaje mixto similar a un dominio (MLKL) son reguladores centrales de la muerte celular necrótica 1,2. La necroptosis es una forma lítica e inflamatoria de muerte celular regulada involucrada en la inmunidad antiviral y la autoinflamación. La necroptosis de las células infectadas por virus detiene inmediatamente la replicación del virus. La lisis celular después de la inducción de necroptosis también libera patrones moleculares asociados al daño, que estimulan la inmunidad antiviral 3,4. La necroptosis se inicia por la activación de RIPK3 después de interacciones mediadas por motivos de interacción homotípica RIP (RHIM) con una de las tres moléculas activadoras aguas arriba: RIPK1 (sobre el compromiso del receptor TNF 1 [TNFR1]), β inductor de interferón inductor de adaptador que contiene dominio TIR (TRIF; en el compromiso de los receptores 3 y 4 tipo Toll), o el sensor antiviral de ácido nucleico Z-DNA proteína de unión al ADN 1 (ZBP1)1,2 . La señalización de necroptosis procede a través de una serie de eventos de fosforilación que comienzan con la autofosforilación de RIPK3. La autofosforilación de RIPK3 humana en serina (S)227 dentro de su dominio quinasa es un requisito previo para la necroptosis al permitir la interacción con MLKL y se usa comúnmente como un marcador bioquímico para la activación de RIPK3 humana y la muerte celular necrótica 1,5. Una vez activado, RIPK3 fosforila el bucle de activación de MLKL en treonina (T)357 y S3581. Esto provoca un cambio en la conformación MLKL, lo que resulta en la exposición del dominio del haz de cuatro hélices N-terminal. MLKL luego oligomeriza y trafica a la membrana celular donde forma un poro a través de la inserción de los cuatro haces helicoidales expuestos en la bicapa lipídica, lo que finalmente conduce a la muerte celular 2,6.
ZBP1 es un sensor de ácido nucleico antiviral que reconoce los ácidos nucleicos zurdos en forma Z, incluido el ARN bicatenario en la conformación Z (ARN Z). La unión al ARN Z se produce a través de dos dominios Zα posicionados en el extremo N de ZBP1. Se cree que el ARN-Z que se acumula durante la infección por virus de ARN y ADN afecta directamente a ZBP1 7,8. ZBP1 activado recluta RIPK3 a través de sus RHIM centrales e induce la muerte celular regulada, incluyendo necroptosis 9,10. Los virus han adoptado numerosos mecanismos de escape para contrarrestar la necroptosis de la célula huésped inducida por ZBP111. Por ejemplo, la subunidad 1 de la ribonucleótido reductasa del virus del herpes simple 1 (HSV-1), conocida como ICP6 y codificada por UL39, alberga RHIM en su extremo N que interfiere con la activación de RIPK3 mediada por ZBP1 en células humanas12,13,14,15. ZBP1 no sólo restringe la replicación viral, sino que los estudios en ratones han demostrado que la activación de ZBP1 causa enfermedades inflamatorias y estimula la inmunidad contra el cáncer 16,17,18,19,20,21. Los protocolos que detectan eventos de señalización que ocurren durante la necroptosis inducida por ZBP1 en células humanas son, por lo tanto, valiosos para evaluar el papel de ZBP1 en estos procesos.
La amplificación de señal de tiramida (TSA), también conocida como deposición catalizada del informador (CARD), se ha desarrollado para mejorar el límite de detección y la relación señal-ruido en inmunoensayos basados en anticuerpos. Durante la TSA, se puede usar cualquier anticuerpo primario para detectar el antígeno de interés. La peroxidasa de rábano picante (HRP), acoplada a un anticuerpo secundario, cataliza la acumulación local de radicales tiramida biotinilados en presencia de peróxido de hidrógeno. Estos radicales de biotina-tiramida activados reaccionan con residuos de tirosina proximales para formar enlaces covalentes. Los sustratos potenciales de tiramida-biotina incluyen el antígeno en sí, los anticuerpos primarios y secundarios y las proteínas vecinas. Por lo tanto, aunque TSA mejora significativamente la sensibilidad del ensayo, parte de su resolución espacial se pierde. En un paso final, las moléculas de biotina se detectan utilizando estreptavidina marcada con fluorescencia. La reacción HRP deposita muchas moléculas de tiramida-biotina en o cerca del antígeno de interés. Esto aumenta en gran medida el número de sitios de unión estreptavidina-fluorocromo, amplificando así en gran medida la sensibilidad del ensayo (Figura 1). Alternativamente, la tiramida se puede acoplar directamente a un fluorocromo, eliminando la necesidad de fluoróforos acoplados a estreptavidina. La inmunohistoquímica de proteínas y la hibridación in situ ADN/ARN estuvieron entre los primeros métodos mediante los cuales se empleó TSA para mejorar las intensidades de señal22,23. Más recientemente, la TSA se ha combinado con la citometría de flujo intracelular24 y la espectrometría de masas25.
Aquí, presentamos un protocolo para detectar serina 227 fosforilada humana RIPK3 (p-RIPK3 [S227]) y MLKL humana fosforilada (p-MLKL [S358]) tras la activación de ZBP1 por infección por HSV-1 utilizando microscopía de inmunofluorescencia. Utilizamos una línea celular de adenocarcinoma colorrectal humano HT-29 sensible a la necroptosis que se transdució para expresar de manera estable ZBP1 humano. Estas células fueron infectadas con una cepa HSV-1 que expresa una proteína ICP6 mutante (HSV-1 ICP6mutRHIM) en la que cuatro aminoácidos centrales dentro del RHIM viral (VQCG) fueron reemplazados por alaninas (AAAA), lo que hace que el ICP6 no pueda bloquear la necroptosis mediada por ZBP113,14,15. Para superar el problema de la baja relación señal-ruido de los anticuerpos actualmente disponibles comercialmente dirigidos contra p-RIPK3 y p-MLKL en inmunotinción26, realizamos un paso de amplificación de señal de tiramida (TSA) (Figura 1), que resulta en la detección robusta de p-RIPK3 humano (S227) y mejora la sensibilidad de detección de p-MLKL humano (S358) en un orden de magnitud.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo de tinción inmunofluorescente describe el uso de la amplificación de señal de tiramida (TSA) para aumentar la sensibilidad a los eventos de señalización de la vía de señalización necropótica humana que son difíciles de detectar, incluida la fosforilación de RIPK3 y MLKL26. La inclusión de un paso TSA mejora significativamente el umbral de detección de p-RIPK3 (S227) y p-MLKL (S358) y aumenta la sensibilidad del esfuerzo p-MLKL (S358). TSA reveló una señal p-RIPK3 (S22…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría agradecer al VIB Bioimaging Core por la capacitación, el apoyo y el acceso al parque de instrumentos. J.N. cuenta con el apoyo de una beca de doctorado de la Fundación de Investigación de Flandes (FWO). La investigación en el grupo J.M. fue apoyada por una beca Odysseus II (G0H8618N), EOS INFLADIS (40007512), una beca de investigación junior (G031022N) de la Fundación de Investigación de Flandes (FWO), una beca de prueba de concepto para jóvenes investigadores de CRIG y por la Universidad de Gante. La investigación en el grupo P.V. contó con el apoyo de EOS MODEL-IDI (30826052), EOS INFLADIS (40007512), FWO senior research grants (G.0C76.18N, G.0B71.18N, G.0B96.20N, G.0A9322N), Methusalem (BOF16/MET_V/007), iBOF20/IBF/039 ATLANTIS, Foundation against Cancer (F/2016/865, F/2020/1505), CRIG y GIGG consorcios, y VIB.
Materials
| Antibodies | |||
| Anti-rabbit HRP | Agilent Technologies Belgium | K4002 | Envision+ System-HRP Labelled Polymer anti-rabbit |
| Goat anti-mouse DyLight 633 | Thermofisher | 35513 | Secundary antibody |
| HSV-1 ICP0 | Santa Cruz | sc-53070 | Mouse anti-ICP0(HSV-1) antibody |
| IAV-PR8 mouse serum | In house production | xx | Mouse anti-IAV-PR8 polyclonal antibody |
| pMLKL | Abcam | ab187091 | Rabbit anti-MLKL-phospho S358 antibody |
| pRIPK3 | Abcam | ab209384 | Rabbit anti-RIPK3-phospho S227 antibody |
| Fluorophores | |||
| DAPI | Thermofisher | D21490 | To visualise the nucleus of the cells |
| Streptavidin coupled to Alexa Fluor 568 | Thermofisher | S11226 | To visulalise biotin molecules |
| Compounds | |||
| 30% H2O2 | Sigma | H1009 | Oxidising substrate, necessary for HRP activity |
| 4% PFA | SANBIO | AR1068 | To fix/crosslink the cells |
| Biotinyl-tyramide | R&D Systems | 6241 | To amplify signal, HRP substrate |
| BV-6 | Selleckchem | S7597 | BV6 IAP Inhibitor |
| For cell culture: to detach the cells | |||
| 8.0 g/L NaCl | |||
| 0.4 g/L disodium salt of EDTA | |||
| EDTA 0.04% | In house formulation | 1.1 g/L Na2HPO4 | |
| 0.2 g/L NaH2PO4 | |||
| 0.2 g/L KCl | |||
| 0.2 g/L Glucose | |||
| Fetal Bovine serum | TICO | FBS EU XXX | For cell culture, maintaining cell culture; lot number: 90439 |
| GSK'840 | Aobious | AOB0917 | RIPK3 kinase inhibitor |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | For cell culture, maintaining cell culture |
| MAXblock | Active Motif | 15252 | Blocking solution |
| PBS | Gibco | 10444402 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | For cell culture, maintaining cell culture |
| TNF-α | In house production | – | Signaling molecule, able to trigger cell death in combination with BV6 and zVAD |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787-50ML | To permeabilise the cells |
| Trypan blue | Merck | 11732 | For cell counting, used as live/dead marker at 0,1% |
| Trypsine | Sigma-Aldrich | T4424 | For cell culture: to detach the cells |
| zVAD | Bachem | BACE4026865.0005 | Z-Val-Ala-DL-Asp-fluoromethylketone |
| Material | |||
| µ-Slide 8 well high glass bottom | iBidi | 80807 | To culture the cells |
| Cotton Preping Balls-size medium | Electron Microscopy Sciences | 71001-10 | To clean the objectives |
| Immersol 518 F / 30 °C | ZEISS | 444970-9000-000 | To visualise the sample at high magnifications |
| Lens Cleaner | ZEISS | 000000-0105-200 | To clean the objectives |
| LSM880 Fast Airyscan confocal microscope | To visualise the sample | ||
| Software | |||
| Excel | Office | xx | To process the data |
| Prism 9 | Graphpad | xx | To analyse the data- statistical testing and graph generation |
| Volocity 6.3 | Volocity | xx | To perform quantifications |
| Zen black | ZEISS | xx | To aquire and process images |
| Zen blue | ZEISS | xx | To visualise images |
| Viruses | |||
| HSV-1 (mutRHIM) F strain | produced by Dr. Jiahuai Han | in house replication | HSV-1 as a trigger for necroptosis; RHIM core domain of UL39/ICP6 is mutated (VQCG>AAAA) |
| HSV-1 (WT) F strain | Produced by Dr. Jiahuai Han | in house replication | HSV-1 (WT) as a negative control for necroptosis induction (ICP6 inhibition) |
| IAV PR8 | in house stock | in house replication | IAV as a trigger for necroptosis |
References
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