Tyramidsignalförstärkning för immunofluorescerande färgning av ZBP1-beroende fosforylering av RIPK3 och MLKL efter HSV-1-infektion i humana celler
Summary
Tyramidsignalförstärkning under immunofluorescerande färgning möjliggör känslig detektion av fosforylerad RIPK3 och MLKL under ZBP1-inducerad nekroptos efter HSV-1-infektion.
Abstract
Kinasreceptor-interagerande serin / treoninproteinkinas 3 (RIPK3) och dess substratblandade härstamningskinasdomänliknande (MLKL) är kritiska regulatorer för nekroptos, en inflammatorisk form av celldöd med viktiga antivirala funktioner. Autofosforylering av RIPK3 inducerar fosforylering och aktivering av det porbildande bödelproteinet av nekroptos MLKL. Trafficking och oligomerisering av fosforylerad MLKL vid cellmembranet resulterar i celllys, som är karakteristisk för nekroptotisk celldöd. Nukleinsyrasensorn ZBP1 aktiveras genom bindning till vänsterhänt Z-form dubbelsträngat RNA (Z-RNA) efter infektion med RNA- och DNA-virus. ZBP1-aktivering begränsar virusinfektion genom att inducera reglerad celldöd, inklusive nekroptos, av infekterade värdceller. Immunofluorescensmikroskopi möjliggör visualisering av olika signalsteg nedströms ZBP1-medierad nekroptos per cell. Känsligheten hos standardfluorescensmikroskopi, med användning av nuvarande kommersiellt tillgängliga fosfospecifika antikroppar mot humana RIPK3 och MLKL, utesluter emellertid reproducerbar avbildning av dessa markörer. Här beskriver vi ett optimerat färgningsförfarande för serin (S) fosforylerad RIPK3 (S227) och MLKL (S358) i humana HT-29-celler infekterade med herpes simplexvirus 1 (HSV-1). Införandet av ett tyramidsignalförstärkningssteg (TSA) i det immunofluorescerande färgningsprotokollet möjliggör specifik detektion av S227 fosforylerad RIPK3. Dessutom ökar TSA kraftigt känsligheten för detekteringen av S358 fosforylerad MLKL. Tillsammans möjliggör denna metod visualisering av dessa två kritiska signalhändelser under induktionen av ZBP1-inducerad nekroptos.
Introduction
Receptor-interagerande serin / treoninproteinkinas 3 (RIPK3) och blandad härstamningskinasdomänliknande (MLKL) är centrala regulatorer för nekroptotisk celldöd 1,2. Nekroptos är en lytisk och inflammatorisk form av reglerad celldöd involverad i antiviral immunitet och autoinflammation. Nekroptos av virusinfekterade celler stänger omedelbart av virusreplikation. Celllys efter nekroptosinduktion frigör också skadeassocierade molekylära mönster, vilket stimulerar antiviral immunitet 3,4. Nekroptos initieras genom aktivering av RIPK3 efter RIP-homotypiska interaktionsmotiv (RHIM)-medierade interaktioner med en av tre uppströms aktiverande molekyler: RIPK1 (vid TNF-receptor 1 [TNFR1] engagemang), TIR-domäninnehållande adapterinducerande interferon-β (TRIF; vid Toll-liknande receptor 3 och 4 engagemang) eller den antivirala nukleinsyrasensorn Z-DNA-bindande protein 1 (ZBP1)1,2 . Nekroptossignalering fortsätter genom en serie fosforyleringshändelser som börjar med autofosforylering av RIPK3. Autofosforylering av human RIPK3 vid serin (S)227 inuti dess kinasdomän är en förutsättning för nekroptos genom att möjliggöra interaktion med MLKL och används vanligtvis som en biokemisk markör för human RIPK3-aktivering och nekroptotisk celldöd 1,5. När den väl är aktiverad fosforylerar RIPK3 aktiveringsslingan för MLKL vid treonin (T)357 och S3581. Detta orsakar en förändring i MLKL-konformationen, vilket resulterar i exponering av den N-terminala fyra helix-buntdomänen. MLKL oligomeriserar sedan och trafikerar till cellmembranet där det bildar en por genom införandet av de exponerade fyra helixbuntarna i lipid-dubbelskiktet, vilket så småningom leder till celldöd 2,6.
ZBP1 är en antiviral nukleinsyrasensor som känner igen vänsterhänta Z-formnukleinsyror inklusive dubbelsträngat RNA i Z-konformationen (Z-RNA). Z-RNA-bindning sker via två Zα-domäner placerade vid N-änden av ZBP1. Z-RNA som ackumuleras under RNA- och DNA-virusinfektion tros direkt engagera ZBP1 7,8. Aktiverad ZBP1 rekryterar RIPK3 genom sina centrala RHIMs och inducerar reglerad celldöd, inklusive nekroptos 9,10. Virus har antagit många flyktmekanismer för att motverka ZBP1-inducerad värdcellsnekroptos11. Till exempel har herpes simplexvirus 1 (HSV-1) ribonukleotidreduktasunderenhet 1, känd som ICP6 och kodad av UL39, RHIM vid sin N-ändpunkt som stör ZBP1-medierad RIPK3-aktivering i mänskliga celler12,13,14,15. ZBP1 begränsar inte bara viral replikation, men musstudier har visat att ZBP1-aktivering orsakar inflammatoriska sjukdomar och stimulerar cancerimmunitet 16,17,18,19,20,21. Protokoll som detekterar signalhändelser som inträffar under ZBP1-inducerad nekroptos i mänskliga celler är därför värdefulla för att bedöma ZBP1: s roll i dessa processer.
Tyramidsignalförstärkning (TSA), även kallad katalyserad reporterdeposition (CARD), har utvecklats för att förbättra detektionsgränsen och signal-brusförhållandet i antikroppsbaserade immunanalyser. Under TSA kan vilken primär antikropp som helst användas för att detektera antigenet av intresse. Pepparrotsperoxidas (HRP), kopplat till en sekundär antikropp, katalyserar den lokala uppbyggnaden av biotinylerade tyramidradikaler i närvaro av väteperoxid. Dessa aktiverade biotin-tyramidradikaler reagerar sedan med proximala tyrosinrester för att bilda kovalenta bindningar. Potentiella tyramid-biotinsubstrat inkluderar själva antigenet, de primära och sekundära antikropparna och angränsande proteiner. Således, medan TSA avsevärt förbättrar analysens känslighet, förloras en del av dess rumsliga upplösning. I ett sista steg detekteras biotinmolekyler med hjälp av fluorescerande märkt streptavidin. HRP-reaktionen avsätter många tyramid-biotinmolekyler på eller nära antigenet av intresse. Detta ökar kraftigt antalet streptavidin-fluorokrombindningsställen, vilket kraftigt förstärker analysens känslighet (figur 1). Alternativt kan tyramid kopplas direkt till en fluorokrom, vilket eliminerar behovet av streptavidinkopplade fluoroforer. Proteinimmunhistokemi och DNA/RNA in situ-hybridisering var bland de första metoderna där TSA användes för att förbättra signalintensiteterna22,23. På senare tid har TSA kombinerats med intracellulär flödescytometri24 och masspektrometri25.
Här presenterar vi ett protokoll för att detektera serin 227 fosforylerad human RIPK3 (p-RIPK3 [S227]) och fosforylerad human MLKL (p-MLKL [S358]) vid aktivering av ZBP1 genom HSV-1-infektion med immunofluorescensmikroskopi. Vi använder en nekroptoskänslig HT-29 human kolorektal adenokarcinomcellinje som transducerades för att stabilt uttrycka human ZBP1. Dessa celler infekterades med en HSV-1-stam som uttryckte ett mutant ICP6-protein (HSV-1 ICP6mutRHIM) i vilket fyra kärnaminosyror i virala RHIM (VQCG) ersattes av alaniner (AAAA), vilket gjorde att ICP6 inte kunde blockera ZBP1-medierad nekroptos13,14,15. För att övervinna problemet med det låga signal-brusförhållandet för de för närvarande kommersiellt tillgängliga antikropparna riktade mot p-RIPK3 och p-MLKL vid immunfärgning26, utför vi ett tyramidsignalförstärkningssteg (TSA) (figur 1), vilket resulterar i robust detektion av humant p-RIPK3 (S227) och förbättrar detektionskänsligheten för humant p-MLKL (S358) med en storleksordning.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta immunofluorescerande färgningsprotokoll beskriver användningen av tyramidsignalförstärkning (TSA) för att öka känsligheten för signalhändelser i den humana nekroptotiska signalvägen som är svåra att upptäcka, inklusive fosforylering av RIPK3 och MLKL26. Införandet av ett TSA-steg förbättrar detektionströskeln för p-RIPK3 (S227) och p-MLKL (S358) avsevärt och ökar känsligheten för p-MLKL (S358) -töjning. TSA avslöjade en p-RIPK3 (S227) signal som redan finns i de mock-…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka VIB Bioimaging Core för utbildning, support och tillgång till instrumentparken. J.N. stöds av ett doktorandstipendium från Research Foundation Flanders (FWO). Forskning i JM-gruppen stöddes av ett Odysseus II-bidrag (G0H8618N), EOS INFLADIS (40007512), ett juniorforskningsbidrag (G031022N) från Research Foundation Flanders (FWO), ett CRIG-bidrag för unga utredare och av Gent University. Forskning i P.V.-gruppen stöddes av EOS MODEL-IDI (30826052), EOS INFLADIS (40007512), FWO senior research grants (G.0C76.18N, G.0B71.18N, G.0B96.20N, G.0A9322N), Methusalem (BOF16/MET_V/007), iBOF20/IBF/039 ATLANTIS, Foundation against Cancer (F/2016/865, F/2020/1505), CRIG- och GIGG-konsortier och VIB.
Materials
| Antibodies | |||
| Anti-rabbit HRP | Agilent Technologies Belgium | K4002 | Envision+ System-HRP Labelled Polymer anti-rabbit |
| Goat anti-mouse DyLight 633 | Thermofisher | 35513 | Secundary antibody |
| HSV-1 ICP0 | Santa Cruz | sc-53070 | Mouse anti-ICP0(HSV-1) antibody |
| IAV-PR8 mouse serum | In house production | xx | Mouse anti-IAV-PR8 polyclonal antibody |
| pMLKL | Abcam | ab187091 | Rabbit anti-MLKL-phospho S358 antibody |
| pRIPK3 | Abcam | ab209384 | Rabbit anti-RIPK3-phospho S227 antibody |
| Fluorophores | |||
| DAPI | Thermofisher | D21490 | To visualise the nucleus of the cells |
| Streptavidin coupled to Alexa Fluor 568 | Thermofisher | S11226 | To visulalise biotin molecules |
| Compounds | |||
| 30% H2O2 | Sigma | H1009 | Oxidising substrate, necessary for HRP activity |
| 4% PFA | SANBIO | AR1068 | To fix/crosslink the cells |
| Biotinyl-tyramide | R&D Systems | 6241 | To amplify signal, HRP substrate |
| BV-6 | Selleckchem | S7597 | BV6 IAP Inhibitor |
| For cell culture: to detach the cells | |||
| 8.0 g/L NaCl | |||
| 0.4 g/L disodium salt of EDTA | |||
| EDTA 0.04% | In house formulation | 1.1 g/L Na2HPO4 | |
| 0.2 g/L NaH2PO4 | |||
| 0.2 g/L KCl | |||
| 0.2 g/L Glucose | |||
| Fetal Bovine serum | TICO | FBS EU XXX | For cell culture, maintaining cell culture; lot number: 90439 |
| GSK'840 | Aobious | AOB0917 | RIPK3 kinase inhibitor |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | For cell culture, maintaining cell culture |
| MAXblock | Active Motif | 15252 | Blocking solution |
| PBS | Gibco | 10444402 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | For cell culture, maintaining cell culture |
| TNF-α | In house production | – | Signaling molecule, able to trigger cell death in combination with BV6 and zVAD |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787-50ML | To permeabilise the cells |
| Trypan blue | Merck | 11732 | For cell counting, used as live/dead marker at 0,1% |
| Trypsine | Sigma-Aldrich | T4424 | For cell culture: to detach the cells |
| zVAD | Bachem | BACE4026865.0005 | Z-Val-Ala-DL-Asp-fluoromethylketone |
| Material | |||
| µ-Slide 8 well high glass bottom | iBidi | 80807 | To culture the cells |
| Cotton Preping Balls-size medium | Electron Microscopy Sciences | 71001-10 | To clean the objectives |
| Immersol 518 F / 30 °C | ZEISS | 444970-9000-000 | To visualise the sample at high magnifications |
| Lens Cleaner | ZEISS | 000000-0105-200 | To clean the objectives |
| LSM880 Fast Airyscan confocal microscope | To visualise the sample | ||
| Software | |||
| Excel | Office | xx | To process the data |
| Prism 9 | Graphpad | xx | To analyse the data- statistical testing and graph generation |
| Volocity 6.3 | Volocity | xx | To perform quantifications |
| Zen black | ZEISS | xx | To aquire and process images |
| Zen blue | ZEISS | xx | To visualise images |
| Viruses | |||
| HSV-1 (mutRHIM) F strain | produced by Dr. Jiahuai Han | in house replication | HSV-1 as a trigger for necroptosis; RHIM core domain of UL39/ICP6 is mutated (VQCG>AAAA) |
| HSV-1 (WT) F strain | Produced by Dr. Jiahuai Han | in house replication | HSV-1 (WT) as a negative control for necroptosis induction (ICP6 inhibition) |
| IAV PR8 | in house stock | in house replication | IAV as a trigger for necroptosis |
References
- Meng, Y., Sandow, J. J., Czabotar, P. E., Murphy, J. M. The regulation of necroptosis by post-translational modifications. Cell Death & Differentiation. 28 (3), 861-883 (2021).
- Petrie, E. J., Czabotar, P. E., Murphy, J. M. The structural basis of necroptotic cell death signaling. Trends in Biochemical Sciences. 44 (1), 53-63 (2019).
- Mocarski, E. S., Guo, H., Kaiser, W. J. Necroptosis: The Trojan horse in cell autonomous antiviral host defense. Virology. 479-480, 160-166 (2015).
- Nailwal, H., Chan, F. K. Necroptosis in anti-viral inflammation. Cell Death & Differentiation. 26 (1), 4-13 (2019).
- Meng, Y., et al. Human RIPK3 maintains MLKL in an inactive conformation prior to cell death by necroptosis. Nature Communications. 12 (1), 6783 (2021).
- Samson, A. L., Garnish, S. E., Hildebrand, J. M., Murphy, J. M. Location, location, location: A compartmentalized view of TNF-induced necroptotic signaling. Science Signalling. 14 (668), (2021).
- Koehler, H., et al. Vaccinia virus E3 prevents sensing of Z-RNA to block ZBP1-dependent necroptosis. Cell Host Microbe. 29 (8), 1266-1276 (2021).
- Balachandran, S., Mocarski, E. S. Viral Z-RNA triggers ZBP1-dependent cell death. Current Opinion in Virology. 51, 134-140 (2021).
- Kuriakose, T., Kanneganti, T. D. ZBP1: Innate sensor regulating cell death and inflammation. Trends in Immunology. 39 (2), 123-134 (2018).
- Maelfait, J., Liverpool, L., Rehwinkel, J. Nucleic acid sensors and programmed cell death. Journal of Molecular Biology. 432 (2), 552-568 (2020).
- Verdonck, S., Nemegeer, J., Vandenabeele, P., Maelfait, J. Viral manipulation of host cell necroptosis and pyroptosis. Trends in Microbiology. 30 (6), 593-605 (2022).
- Guo, H., et al. Herpes simplex virus suppresses necroptosis in human cells. Cell Host & Microbe. 17 (2), 243-251 (2015).
- Yu, X., et al. Herpes simplex virus 1 (HSV-1) and HSV-2 mediate species-specific modulations of programmed necrosis through the viral ribonucleotide reductase large subunit R1. Journal of Virology. 90 (2), 1088-1095 (2016).
- Huang, Z., et al. RIP1/RIP3 binding to HSV-1 ICP6 initiates necroptosis to restrict virus propagation in mice. Cell Host & Microbe. 17 (2), 229-242 (2015).
- Guo, H., et al. Species-independent contribution of ZBP1/DAI/DLM-1-triggered necroptosis in host defense against HSV1. Cell Death & Disease. 9 (8), 816 (2018).
- Devos, M., et al. Sensing of endogenous nucleic acids by ZBP1 induces keratinocyte necroptosis and skin inflammation. The Journal of Experimental Medicine. 217 (7), 20191913 (2020).
- Jiao, H., et al. Z-nucleic-acid sensing triggers ZBP1-dependent necroptosis and inflammation. Nature. 580 (7803), 391-395 (2020).
- de Reuver, R., et al. ADAR1 prevents autoinflammation by suppressing spontaneous ZBP1 activation. Nature. 607 (7920), 784-789 (2022).
- Jiao, H., et al. ADAR1 averts fatal type I interferon induction by ZBP1. Nature. 607 (7920), 776-783 (2022).
- Hubbard, N. W., et al. ADAR1 mutation causes ZBP1-dependent immunopathology. Nature. 607 (7920), 769-775 (2022).
- Zhang, T., et al. ADAR1 masks the cancer immunotherapeutic promise of ZBP1-driven necroptosis. Nature. 606 (7914), 594-602 (2022).
- Adams, J. C. Biotin amplification of biotin and horseradish peroxidase signals in histochemical stains. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 40 (10), 1457-1463 (1992).
- Speel, E. J., Hopman, A. H., Komminoth, P. Tyramide signal amplification for DNA and mRNA in situ hybridization. Methods in Molecular Biology. 326, 33-60 (2006).
- Clutter, M. R., Heffner, G. C., Krutzik, P. O., Sachen, K. L., Nolan, G. P. Tyramide signal amplification for analysis of kinase activity by intracellular flow cytometry. Cytometry A. 77 (11), 1020-1031 (2010).
- Dopie, J., Sweredoski, M. J., Moradian, A., Belmont, A. S. Tyramide signal amplification mass spectrometry (TSA-MS) ratio identifies nuclear speckle proteins. The Journal of Cell Biology. 219 (9), 201910207 (2020).
- Samson, A. L., et al. A toolbox for imaging RIPK1, RIPK3, and MLKL in mouse and human cells. Cell Death and Differentiation. 28 (7), 2126-2144 (2021).
- De Groote, P., et al. Generation of a new gateway-compatible inducible lentiviral vector platform allowing easy derivation of co-transduced cells. Biotechniques. 60 (5), 252-259 (2016).
- Ali, M., Roback, L., Mocarski, E. S. Herpes simplex virus 1 ICP6 impedes TNF receptor 1-induced necrosome assembly during compartmentalization to detergent-resistant membrane vesicles. The Journal of Biological Chemistry. 294 (3), 991-1004 (2019).
- Mandal, P., et al. RIP3 induces apoptosis independent of pronecrotic kinase activity. Moleular Cell. 56 (4), 481-495 (2014).
- Zhang, T., et al. Influenza virus Z-RNAs induce ZBP1-mediated necroptosis. Cell. 180 (6), 1115-1129 (2020).
- Garnish, S. E., et al. Conformational interconversion of MLKL and disengagement from RIPK3 precede cell death by necroptosis. Nature Communications. 12 (1), 2211 (2021).
- Clay, H., Ramakrishnan, L. Multiplex fluorescent in situ hybridization in zebrafish embryos using tyramide signal amplification. Zebrafish. 2 (2), 105-111 (2005).
- Parra, E. R., et al. Procedural requirements and recommendations for multiplex immunofluorescence tyramide signal amplification assays to support translational oncology studies. Cancers. 12 (2), 255 (2020).
