Aptamer-baseret måldetektion lettet af en 3-trins G-quadruplex isotermisk eksponentiel forstærkningsreaktion
Summary
Denne protokol demonstrerer brugen af et hurtigt, 3-trins, aptamerbaseret eksponentielt forstærkningsassay til at detektere mål. Prøveforberedelse, signalforstærkning og farveudvikling er dækket for at implementere dette system for at genkende tilstedeværelsen af theophyllin over koffein.
Abstract
Aptamers er målgenkendelsesmolekyler, der binder med høj affinitet og specificitet. Disse egenskaber kan udnyttes til at styre andre molekyler med signalgenereringsevne. For det system, der er beskrevet heri, aktiverer målgenkendelse gennem et aptamerisk domæne, stamme II af et modificeret hammerhovedribozym, det selvspaltende ribozym ved at stabilisere den oprindeligt ustrukturerede konstruktion. Det cis-spaltende RNA virker ved krydset mellem stamme III og stamme I, hvilket skaber to spaltningsprodukter. Det længere spaltningsprodukt primer en isotermisk eksponentiel amplifikationsreaktion (EXPAR) af de to lignende katalytisk aktive G-quadruplexer. Disse resulterende forstærkningsprodukter katalyserer peroxidasereduktion, som er koblet til reduktionen af et kolorimetrisk substrat med et output, som det blotte øje kan detektere. Det 3-delte system, der er beskrevet i denne undersøgelse, forbedrer detektionsmetoder såsom enzymbundne immunosorbentassays (ELISA’er) ved at producere et visuelt detekterbart signal til indikation af tilstedeværelsen af så lavt som 0,5 μM theophyllin på så lidt som 15 min.
Introduction
Aptamerer er typisk enkeltstrenget DNA eller RNA udvalgt gennem en evolutionær proces med høj bindingsaffinitet og specificitet til de ønskede mål1. Ud over bindingsevne kan aptamerer forbindes til og styre motiver med signaludgangsfunktioner2,3, hvilket forstærker signalet og forbedrer systemets følsomhed. G-quadruplex isotermisk eksponentiel forstærkningsreaktion (GQ-EXPAR) system er et tredelt system (figur 1), der udvikler et visuelt signal, når successive komponenter føjes til en enkelt reaktionsbeholder for at producere et visuelt output4. Dette system giver mulighed for detektion af et specifikt mål, heri theophyllin, i en given prøve inden for 15 minutter ved hjælp af en strømlinet arbejdsgang for at muliggøre hurtig, specifik detektion af et mål af interesse. Denne metode skal overvejes for prøver, hvor specifik kvantificering af målkoncentrationen er mindre problematisk end en høj grad af responsspecificitet på kort tid.
En allosterisk riboswitch, et strukturomskiftende RNA-molekyle (ribozym), der gennemgår selvspaltning, producerer det indledende signal. Denne konstruktion er baseret på hammerhead ribozym, med et aptamerisk domæne introduceret i Stem II som regulator af spaltningsaktivitet. Dens selvspaltningsfunktion aktiveres, når dens aptameriske domæne stabiliseres ved binding til sit mål5. Ellers er kontakten inaktiv i sin oprindelige tilstand.
Den efterfølgende eksponentielle amplifikationsreaktion (EXPAR) bruger frigivelsen af den selvspaltede RNA-streng fra det første trin til at prime en isotermisk amplifikationsreaktion6. Forstærkningsproduktet af EXPAR har peroxidaseaktivitet7, der fungerer som grundlag for systemets sidste trin. Når nogle substrater oxideres i forbindelse med peroxidnedbrydning, producerer de et fluorescerende output, der kan måles på forskellige instrumenter. Andre almindelige substrater kan erstattes for at producere et farvet produkt til visuel detektion. EXPAR og peroxidaseaktiviteten af dets amplifikationsprodukter fungerer som en 2-trins signalforstærker, der øger følsomheden over for større niveauer sammenlignet med konventionelle strategier 7,8.
Påvisning af theophyllin versus koffein anvendes som et eksempel på specificiteten af denne detektionsplatform, da de kun adskiller sig med en enkelt methylgruppe (figur 2). Denne demonstration af systemet frembringer et kolorimetrisk output til visuel detektion af mindst 500 nM theophyllin.
Protocol
Representative Results
Discussion
Metoden, der præsenteres her, udnytter overgangen mellem en oprindeligt uordnet sekundær struktur i et allosterisk ribozym og den yderligere stabilitet, der opnås ved binding af målet til det aptameriske domæne for at aktivere cis-spaltende hammerhovedribozym. Stabiliteten af ribozymet blev justeret for at minimere katalytisk aktivitet i fravær af målet, samtidig med at målbindingen kunne genoprette den aktive struktur. Derudover skal man sørge for at afbalancere bufferne af de mange enzymer, der kræves for at …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskning blev støttet af forsknings- og udviklingsfinansiering fra Aptagen LLC.
Materials
| 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine dihydrochloride (TMB) solution with H2O2, "MaxSignal TMB Microwell Substrate Solution" | PerkinElmer | FOOD-1806-1000 | Color development reagent. Minimize exposure to light and atmosphere. Previously BIOO Scientific catalog number 1806. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 3-2. |
| 5’- TCC CTC CCT CCC TCC CAG TCC AGA CTC TTC CCT CCC TCC CTC CCA GA-Biotin-3’ | Integrated DNA Technologies (IDT) | Custom | Optimized QtQ47 DNA template for EXPAR to produce G-quadruplex, primed by G-quadruplex. This is used for the "exponential" part of EXPAR, to rapidly increase the amount of DNAzyme used for Step 3 color development. Template includes a 3'-biotin to prevent unintended extension by Bst 2.0 DNA polymerase during EXPAR. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2. |
| 5’-GGG AAC UAU ACA ACC UAG GGC GAC CCU GAU GAG CCU UAU ACC AGC CGA AAG GCC CUU GGC AGA CGU UGA AAC GGU GAA AGC CGU AGG UUG CCC UAG GUU GUA UAG UU-3’ | Integrated DNA Technologies (IDT) | Custom | Theophylline-recognizing allosteric ribozyme sequence (self-cleaving ribozyme regulated by RNA aptamer domain for theophylline) modified from Soukup et al. Soukup, G. A., Emilsson, G. A., and Breaker, R. R. (2000) Altering molecular recognition of RNA aptamers by allosteric selection, Journal of molecular biology 298, 623-632. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-3. |
| 5’-TCC CTC CCT CCC TCC CAG TCC AGA CTC TAC GGC TTT CAC CGT TTC AAC G-Biotin-3’ | Integrated DNA Technologies (IDT) | Custom | Optimized P3tQ49 DNA template for EXPAR to produce G-quadruplex, primed by P3 cleavage product. This is used in Step 2 to translate the cleavage product into DNAzyme used for Step 3 color development. Template includes a 3'-biotin to prevent unintended extension by Bst 2.0 DNA polymerase during EXPAR. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2. |
| 5x Ribozyme Buffer | Aptagen, LLC | N/A | 5x composition: 600 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM MgCl2, 25 mM DTT. Used in Step 1. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-4. |
| Apta-beaconTM (GQ-EXPAR, TMB) Demonstration Kit | Aptagen, LLC | GQ-EXPAR-TMB | The demo kit showcases the specificity of the colorimetric assay by detecting difficult small molecule targets, theophylline versus caffeine, which only differ by a single methyl group. |
| Bst 2.0 DNA polymerase | New England Biolabs | M0537S | Isothermal amplification polymerase with strand-displacement activity. Part of the Nickase-Polymerase Mix, prepared at 9.375 U/uL. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-1. |
| Buffer 3.1 | New England Biolabs | B6003SVIAL | Combined with 2 uL of 10X Isothermal Amplification Buffer and 27.5 uL of nuclease-free water to produce 1.11X EXPAR Buffer in EXPAR Mix. This product replaces the previously-used B7203SVIAL that was part of the initial system development (same composition except non-recombinant BSA). Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2. |
| Caffeine | Sigma-Aldrich | C0750-100G | Aptamer counter-target (control), prepared with nuclease-free water. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-1. |
| dNTPs | New England Biolabs | N0447S | Part of the EXPAR reaction mixture. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2. |
| EXPAR reaction mixture | Aptagen, LLC | N/A | 0.44 mM dNTPs, 0.38 μM P3tQ49, 0.38 μM QtQ47, 44.44 mM Tris-HCl (pH 8.4), 63.5 mM NaCl, 31.5 mM KCl, 6.35 mM MgCl2, 1.27 mM MgSO4, 6.35 mM (NH4)2SO4, 63.5 μg/ml BSA, 0.0635 % Tween 20. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2. |
| Hemin | Sigma-Aldrich | H9039 | Resuspended in DMF to a final concentration of 25 uM. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 3-1. |
| Isothermal Amplification Buffer | New England Biolabs | B0537SVIAL | Combined with 2 uL of 10x Buffer 3.1 and 27.5 µL of nuclease-free water to produce 1.11x EXPAR Buffer in EXPAR Mix. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2. |
| MgCl2 | Amresco (VWR) | E525-500ML | Hammerhead ribozyme cofactor, necessary for self-cleavage. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 1-3. |
| MJ PTC-100 Thermocycler | MJ Research, Inc. | PTC-100 | Thermocycler to control incubation temperatures. Any thermocycler or hot block can be used. |
| N, N-Dimethylformamide (DMF) | Sigma-Aldrich | 227056-100ML | Used to resuspend hemin and maximize shelf life in freezer. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 3-1. |
| Nickase-polymerase Mix | Aptagen, LLC | N/A | Nt.BstNBI (9.375 units/μL) and Bst 2.0 DNA polymerase (0.5 units/μL). Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 2-1. |
| Nt.BstNBI | New England Biolabs | R0607S | Nicking enzyme to allow continued isothermal amplification. Part of the Nickase-Polymerase Mix, prepared at 0.5 U/uL. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-1. |
| T4 Kinase Buffer | New England Biolabs | B0201SVIAL | Buffer for enzyme necessary to remove cyclic phosphate. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 1-4. |
| T4 polynucleotide kinase | New England Biolabs | M0201S | Removes cyclic phosphate post-cleavage to allow cleavage product to prime isothermal amplification reaction. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as PCR Tubes. |
| Tecan GENios FL | Tecan | Genios-FL TWT | Plate reader to measure absorbance signal from Step 3 results. |
| Theophylline | Sigma-Aldrich | T1633-50G | Aptamer target, prepared with nuclease-free water. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-2. |
| Tris-HCl | American Bioanalytical | AB14043-01000 | Aptamer binding buffer. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 1-4. |
References
- Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).
- Tang, J., Breaker, R. R. Rational design of allosteric ribozymes. Chemical Biology. 4 (6), 453-459 (1997).
- Stoltenburg, R., Reinemann, C., Strehlitz, B. SELEX–A (r)evolutionary method to generate high-affinity nucleic acid ligands. Biomolecular Engineering. 24 (4), 381-403 (2007).
- Liao, A. M., et al. A simple colorimetric system for detecting target antigens by a three-stage signal transformation-amplification strategy. 생화학. 57 (34), 5117-5126 (2018).
- Soukup, G. A., Emilsson, G. A., Breaker, R. R. Altering molecular recognition of RNA aptamers by allosteric selection. Journal of Molecular Biology. 298 (4), 623-632 (2000).
- Van Ness, J., Van Ness, L. K., Galas, D. J. Isothermal reactions for the amplification of oligonucleotides. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (8), 4504-4509 (2003).
- Cheng, X., Liu, X., Bing, T., Cao, Z., Shangguan, D. General peroxidase activity of G-quadruplex-hemin complexes and its application in ligand screening. 생화학. 48 (33), 7817-7823 (2009).
- Nie, J., et al. Reporter-triggered isothermal exponential amplification strategy in ultrasensitive homogeneous label-free electrochemical nucleic acid biosensing. Chemical Communications. 50 (47), 6211-6213 (2014).
- Tabuchi, T., Yokobayashi, Y. Cell-free riboswitches. RSC Chemical Biology. 2 (5), 1430-1440 (2021).
- Ao, Y., et al. Integration of an expression platform in the SELEX cycle to select DNA aptamer binding to a disease biomarker. ACS Omega. 7 (12), 10804-10811 (2022).
