Detección de objetivos basada en aptámeros facilitada por una reacción de amplificación exponencial isotérmica G-quadruplex de 3 etapas
Summary
El protocolo actual demuestra el uso de un ensayo de amplificación exponencial rápido, de 3 etapas, basado en aptámeros para detectar objetivos. La preparación de la muestra, la amplificación de la señal y el desarrollo del color están cubiertos para implementar este sistema para reconocer la presencia de teofilina sobre la de cafeína.
Abstract
Los aptámeros son moléculas de reconocimiento de objetivos que se unen con alta afinidad y especificidad. Estas características se pueden aprovechar para controlar otras moléculas con capacidad de generación de señales. Para el sistema descrito en este documento, el reconocimiento de objetivos a través de un dominio aptámero, Stem II de una ribozima de cabeza de martillo modificada, activa la ribozima autoescindida estabilizando la construcción inicialmente no estructurada. El ARN cis-escindido actúa en la unión de Stem III y Stem I, creando dos productos de escisión. El producto de escisión más largo prepara una reacción de amplificación exponencial isotérmica (EXPAR) de los dos G-cuádruples catalíticamente activos similares. Esos productos de amplificación resultantes catalizan la reducción de la peroxidasa, que se acopla a la reducción de un sustrato colorimétrico con una salida que el ojo desnudo puede detectar. El sistema de 3 partes descrito en el presente estudio mejora las modalidades de detección, como los ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA) al producir una señal visualmente detectable para indicar la presencia de teofilina tan baja como 0.5 μM en tan solo 15 minutos.
Introduction
Los aptámeros son típicamente ADN o ARN monocatenario seleccionados a través de un proceso evolutivo con alta afinidad y especificidad de unión a los objetivos deseados1. Además de la capacidad de unión, los aptámeros pueden vincularse y controlar motivos con funciones de salida de señal2,3, amplificando dicha señal y mejorando la sensibilidad del sistema. El sistema de reacción de amplificación exponencial isotérmica G-quadruplex (GQ-EXPAR) es un sistema de tres partes (Figura 1) que desarrolla una señal visual a medida que se agregan componentes sucesivos a un solo recipiente de reacción para producir una salida visual4. Este sistema permite la detección de un objetivo específico, aquí teofilina, en una muestra dada dentro de los 15 minutos utilizando un flujo de trabajo simplificado para permitir la detección rápida y específica de un objetivo de interés. Este método debe considerarse para muestras en las que la cuantificación específica de la concentración objetivo sea menos preocupante que la alta especificidad de la respuesta en un corto período de tiempo.
Un riboswitch alostérico, una molécula de ARN que cambia de estructura (ribozima) que sufre autoescisión, produce la señal inicial. Esta construcción se basa en la ribozima cabeza de martillo, con un dominio aptámero introducido en Stem II como regulador de la actividad de escisión. Su función de autoescisión se activa cuando su dominio aptámero se estabiliza al unirse a su objetivo5. De lo contrario, el conmutador está inactivo en su estado nativo.
La reacción de amplificación exponencial posterior (EXPAR) utiliza la liberación de la cadena de ARN autoescindida desde la primera etapa para preparar una reacción de amplificación isotérmica6. El producto de amplificación de EXPAR tiene actividad peroxidasa7, actuando como base para la última etapa del sistema. Cuando algunos sustratos se oxidan junto con la descomposición del peróxido, producen una salida fluorescente que se puede medir en varios instrumentos. Otros sustratos comunes pueden ser sustituidos para producir un producto coloreado para la detección visual. EXPAR y la actividad peroxidasa de sus productos de amplificación actúan como un potenciador de señal de 2 etapas, aumentando la sensibilidad a mayores niveles en comparación con las estrategias convencionales 7,8.
La detección de teofilina versus cafeína se utiliza como un ejemplo de la especificidad de esta plataforma de detección, ya que difieren en un solo grupo metilo (Figura 2). Esta demostración del sistema produce una salida colorimétrica para la detección visual de al menos 500 nM de teofilina.
Protocol
Representative Results
Discussion
El método presentado aquí aprovecha la transición entre una estructura secundaria inicialmente desordenada en una ribozima alostérica y la estabilidad adicional conferida a través de la unión del objetivo al dominio aptámero para activar la ribozima de cabeza de martillo cis-escindida. La estabilidad de la ribozima se ajustó para minimizar la actividad catalítica en ausencia del objetivo, al tiempo que permite la unión del objetivo para restaurar la estructura activa. Además, se debe tener cuidado para equilib…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación fue apoyada por la financiación de investigación y desarrollo de Aptagen LLC.
Materials
| 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine dihydrochloride (TMB) solution with H2O2, "MaxSignal TMB Microwell Substrate Solution" | PerkinElmer | FOOD-1806-1000 | Color development reagent. Minimize exposure to light and atmosphere. Previously BIOO Scientific catalog number 1806. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 3-2. |
| 5’- TCC CTC CCT CCC TCC CAG TCC AGA CTC TTC CCT CCC TCC CTC CCA GA-Biotin-3’ | Integrated DNA Technologies (IDT) | Custom | Optimized QtQ47 DNA template for EXPAR to produce G-quadruplex, primed by G-quadruplex. This is used for the "exponential" part of EXPAR, to rapidly increase the amount of DNAzyme used for Step 3 color development. Template includes a 3'-biotin to prevent unintended extension by Bst 2.0 DNA polymerase during EXPAR. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2. |
| 5’-GGG AAC UAU ACA ACC UAG GGC GAC CCU GAU GAG CCU UAU ACC AGC CGA AAG GCC CUU GGC AGA CGU UGA AAC GGU GAA AGC CGU AGG UUG CCC UAG GUU GUA UAG UU-3’ | Integrated DNA Technologies (IDT) | Custom | Theophylline-recognizing allosteric ribozyme sequence (self-cleaving ribozyme regulated by RNA aptamer domain for theophylline) modified from Soukup et al. Soukup, G. A., Emilsson, G. A., and Breaker, R. R. (2000) Altering molecular recognition of RNA aptamers by allosteric selection, Journal of molecular biology 298, 623-632. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-3. |
| 5’-TCC CTC CCT CCC TCC CAG TCC AGA CTC TAC GGC TTT CAC CGT TTC AAC G-Biotin-3’ | Integrated DNA Technologies (IDT) | Custom | Optimized P3tQ49 DNA template for EXPAR to produce G-quadruplex, primed by P3 cleavage product. This is used in Step 2 to translate the cleavage product into DNAzyme used for Step 3 color development. Template includes a 3'-biotin to prevent unintended extension by Bst 2.0 DNA polymerase during EXPAR. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2. |
| 5x Ribozyme Buffer | Aptagen, LLC | N/A | 5x composition: 600 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM MgCl2, 25 mM DTT. Used in Step 1. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-4. |
| Apta-beaconTM (GQ-EXPAR, TMB) Demonstration Kit | Aptagen, LLC | GQ-EXPAR-TMB | The demo kit showcases the specificity of the colorimetric assay by detecting difficult small molecule targets, theophylline versus caffeine, which only differ by a single methyl group. |
| Bst 2.0 DNA polymerase | New England Biolabs | M0537S | Isothermal amplification polymerase with strand-displacement activity. Part of the Nickase-Polymerase Mix, prepared at 9.375 U/uL. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-1. |
| Buffer 3.1 | New England Biolabs | B6003SVIAL | Combined with 2 uL of 10X Isothermal Amplification Buffer and 27.5 uL of nuclease-free water to produce 1.11X EXPAR Buffer in EXPAR Mix. This product replaces the previously-used B7203SVIAL that was part of the initial system development (same composition except non-recombinant BSA). Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2. |
| Caffeine | Sigma-Aldrich | C0750-100G | Aptamer counter-target (control), prepared with nuclease-free water. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-1. |
| dNTPs | New England Biolabs | N0447S | Part of the EXPAR reaction mixture. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2. |
| EXPAR reaction mixture | Aptagen, LLC | N/A | 0.44 mM dNTPs, 0.38 μM P3tQ49, 0.38 μM QtQ47, 44.44 mM Tris-HCl (pH 8.4), 63.5 mM NaCl, 31.5 mM KCl, 6.35 mM MgCl2, 1.27 mM MgSO4, 6.35 mM (NH4)2SO4, 63.5 μg/ml BSA, 0.0635 % Tween 20. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2. |
| Hemin | Sigma-Aldrich | H9039 | Resuspended in DMF to a final concentration of 25 uM. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 3-1. |
| Isothermal Amplification Buffer | New England Biolabs | B0537SVIAL | Combined with 2 uL of 10x Buffer 3.1 and 27.5 µL of nuclease-free water to produce 1.11x EXPAR Buffer in EXPAR Mix. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2. |
| MgCl2 | Amresco (VWR) | E525-500ML | Hammerhead ribozyme cofactor, necessary for self-cleavage. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 1-3. |
| MJ PTC-100 Thermocycler | MJ Research, Inc. | PTC-100 | Thermocycler to control incubation temperatures. Any thermocycler or hot block can be used. |
| N, N-Dimethylformamide (DMF) | Sigma-Aldrich | 227056-100ML | Used to resuspend hemin and maximize shelf life in freezer. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 3-1. |
| Nickase-polymerase Mix | Aptagen, LLC | N/A | Nt.BstNBI (9.375 units/μL) and Bst 2.0 DNA polymerase (0.5 units/μL). Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 2-1. |
| Nt.BstNBI | New England Biolabs | R0607S | Nicking enzyme to allow continued isothermal amplification. Part of the Nickase-Polymerase Mix, prepared at 0.5 U/uL. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-1. |
| T4 Kinase Buffer | New England Biolabs | B0201SVIAL | Buffer for enzyme necessary to remove cyclic phosphate. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 1-4. |
| T4 polynucleotide kinase | New England Biolabs | M0201S | Removes cyclic phosphate post-cleavage to allow cleavage product to prime isothermal amplification reaction. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as PCR Tubes. |
| Tecan GENios FL | Tecan | Genios-FL TWT | Plate reader to measure absorbance signal from Step 3 results. |
| Theophylline | Sigma-Aldrich | T1633-50G | Aptamer target, prepared with nuclease-free water. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-2. |
| Tris-HCl | American Bioanalytical | AB14043-01000 | Aptamer binding buffer. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 1-4. |
References
- Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).
- Tang, J., Breaker, R. R. Rational design of allosteric ribozymes. Chemical Biology. 4 (6), 453-459 (1997).
- Stoltenburg, R., Reinemann, C., Strehlitz, B. SELEX–A (r)evolutionary method to generate high-affinity nucleic acid ligands. Biomolecular Engineering. 24 (4), 381-403 (2007).
- Liao, A. M., et al. A simple colorimetric system for detecting target antigens by a three-stage signal transformation-amplification strategy. 생화학. 57 (34), 5117-5126 (2018).
- Soukup, G. A., Emilsson, G. A., Breaker, R. R. Altering molecular recognition of RNA aptamers by allosteric selection. Journal of Molecular Biology. 298 (4), 623-632 (2000).
- Van Ness, J., Van Ness, L. K., Galas, D. J. Isothermal reactions for the amplification of oligonucleotides. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (8), 4504-4509 (2003).
- Cheng, X., Liu, X., Bing, T., Cao, Z., Shangguan, D. General peroxidase activity of G-quadruplex-hemin complexes and its application in ligand screening. 생화학. 48 (33), 7817-7823 (2009).
- Nie, J., et al. Reporter-triggered isothermal exponential amplification strategy in ultrasensitive homogeneous label-free electrochemical nucleic acid biosensing. Chemical Communications. 50 (47), 6211-6213 (2014).
- Tabuchi, T., Yokobayashi, Y. Cell-free riboswitches. RSC Chemical Biology. 2 (5), 1430-1440 (2021).
- Ao, Y., et al. Integration of an expression platform in the SELEX cycle to select DNA aptamer binding to a disease biomarker. ACS Omega. 7 (12), 10804-10811 (2022).
