Aptamer tabanlı hedef tespiti, 3 aşamalı G-dörtlü izotermal üstel amplifikasyon reaksiyonu ile kolaylaştırılmıştır
Summary
Mevcut protokol, hedefleri tespit etmek için hızlı, 3 aşamalı, aptamer tabanlı üstel amplifikasyon testinin kullanımını göstermektedir. Numune hazırlama, sinyal amplifikasyonu ve renk gelişimi, kafein üzerinde teofilin varlığını tanımak için bu sistemi uygulamak için ele alınmıştır.
Abstract
Aptamerler, yüksek afinite ve özgüllükle bağlanan hedef tanıma molekülleridir. Bu özellikler, sinyal üretme kabiliyetine sahip diğer molekülleri kontrol etmek için kullanılabilir. Burada açıklanan sistem için, modifiye edilmiş bir çekiç kafalı ribozimin Kök II’si olan aptamerik bir alan aracılığıyla hedef tanıma, başlangıçta yapılandırılmamış yapıyı stabilize ederek kendiliğinden yarılan ribozimi aktive eder. Cis-cleaving RNA, Kök III ve Kök I’in birleşme noktasında hareket eder ve iki bölünme ürünü oluşturur. Daha uzun bölünme ürünü, iki benzer katalitik olarak aktif G-dörtlüsünün izotermal üstel amplifikasyon reaksiyonunu (EXPAR) hazırlar. Ortaya çıkan bu amplifikasyon ürünleri, çıplak gözün algılayabileceği bir çıkışla kolorimetrik bir substratın indirgenmesine bağlı olan peroksidaz indirgemesini katalize eder. Bu çalışmada açıklanan 3 parçalı sistem, enzime bağlı immünosorbent tahlilleri (ELISA’lar) gibi tespit yöntemlerini, 15 dakika gibi kısa bir sürede 0.5 μM teofilin kadar düşük bir sürede varlığını göstermek için görsel olarak tespit edilebilir bir sinyal üreterek geliştirir.
Introduction
Aptamerler tipik olarak, istenen hedeflere yüksek bağlanma afinitesi ve özgüllüğü olan evrimsel bir süreçle seçilen tek sarmallı DNA veya RNA’dır1. Bağlama kabiliyetine ek olarak, aptamerler sinyal çıkış fonksiyonları2,3 ile motiflere bağlanabilir ve kontrol edilebilir, bu da söz konusu sinyali yükseltir ve sistemin hassasiyetini arttırır. G-dörtlü izotermal üstel amplifikasyon reaksiyonu (GQ-EXPAR) sistemi, görsel bir çıktıüretmek için tek bir reaksiyon kabına ardışık bileşenler eklendikçe görsel bir sinyal geliştiren üç parçalı bir sistemdir (Şekil 1). Bu sistem, ilgilenilen bir hedefin hızlı ve spesifik bir şekilde tespit edilmesini sağlamak için kolaylaştırılmış bir iş akışı kullanarak belirli bir numunedeki belirli bir hedefin, burada teofilin 15 dakika içinde tespit edilmesini sağlar. Bu yöntem, hedef konsantrasyonun spesifik niceliğinin, kısa sürede yanıtın yüksek özgüllüğünden daha düşük bir endişe kaynağı olduğu numuneler için düşünülmelidir.
Bir allosterik riboswitch, kendi kendine bölünmeye uğrayan bir yapı değiştiren RNA molekülü (ribozim), başlangıç sinyalini üretir. Bu yapı, Kök II’de bölünme aktivitesinin düzenleyicisi olarak tanıtılan aptamerik bir alana sahip çekiç kafalı ribozime dayanmaktadır. Kendi kendine bölünme fonksiyonu, aptamerik alanı hedef5’e bağlandığında stabilize edildiğinde aktive olur. Aksi takdirde, anahtar yerel durumunda etkin değildir.
Sonraki üstel amplifikasyon reaksiyonu (EXPAR), bir izotermal amplifikasyon reaksiyonu6’yı asal hale getirmek için kendinden parçalanmış RNA ipliğinin ilk aşamadan salınmasını kullanır. EXPAR’ın amplifikasyon ürünü, sistemin son aşaması için temel görevi gören peroksidaz aktivitesi7’ye sahiptir. Bazı substratlar peroksit parçalanması ile birlikte oksitlendiğinde, çeşitli enstrümantasyonda ölçülebilen bir floresan çıkışı üretirler. Diğer yaygın substratlar, görsel algılama için renkli bir ürün üretmek üzere değiştirilebilir. EXPAR ve amplifikasyon ürünlerinin peroksidaz aktivitesi, 2 aşamalı bir sinyal arttırıcı olarak işlev görür ve geleneksel stratejilere kıyasla duyarlılığı daha yüksek seviyelere çıkarır 7,8.
Teofilin kafeine karşı teofilin tespiti, sadece tek bir metil grubuna göre farklılık gösterdikleri için bu algılama platformunun özgüllüğünün bir örneği olarak kullanılır (Şekil 2). Sistemin bu gösterimi, en az 500 nM teofilin görsel tespiti için kolorimetrik bir çıktı üretir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada sunulan yöntem, allosterik bir ribozimde başlangıçta düzensiz bir ikincil yapı ile cis-yarık çekiç kafası ribozimini aktive etmek için hedefin aptamerik alana bağlanması yoluyla sağlanan ek stabilite arasındaki geçişten yararlanır. Ribozimin stabilitesi, hedefin yokluğunda katalitik aktiviteyi en aza indirgemek için ayarlanırken, hedef bağlamanın aktif yapıyı restore etmesine izin verdi. Ek olarak, EXPAR ve renk gelişimini kolaylaştırmak için gerekli çoklu enzimlerin tamponlarını de…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma, Aptagen LLC’nin Araştırma ve Geliştirme Fonu tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine dihydrochloride (TMB) solution with H2O2, "MaxSignal TMB Microwell Substrate Solution" | PerkinElmer | FOOD-1806-1000 | Color development reagent. Minimize exposure to light and atmosphere. Previously BIOO Scientific catalog number 1806. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 3-2. |
| 5’- TCC CTC CCT CCC TCC CAG TCC AGA CTC TTC CCT CCC TCC CTC CCA GA-Biotin-3’ | Integrated DNA Technologies (IDT) | Custom | Optimized QtQ47 DNA template for EXPAR to produce G-quadruplex, primed by G-quadruplex. This is used for the "exponential" part of EXPAR, to rapidly increase the amount of DNAzyme used for Step 3 color development. Template includes a 3'-biotin to prevent unintended extension by Bst 2.0 DNA polymerase during EXPAR. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2. |
| 5’-GGG AAC UAU ACA ACC UAG GGC GAC CCU GAU GAG CCU UAU ACC AGC CGA AAG GCC CUU GGC AGA CGU UGA AAC GGU GAA AGC CGU AGG UUG CCC UAG GUU GUA UAG UU-3’ | Integrated DNA Technologies (IDT) | Custom | Theophylline-recognizing allosteric ribozyme sequence (self-cleaving ribozyme regulated by RNA aptamer domain for theophylline) modified from Soukup et al. Soukup, G. A., Emilsson, G. A., and Breaker, R. R. (2000) Altering molecular recognition of RNA aptamers by allosteric selection, Journal of molecular biology 298, 623-632. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-3. |
| 5’-TCC CTC CCT CCC TCC CAG TCC AGA CTC TAC GGC TTT CAC CGT TTC AAC G-Biotin-3’ | Integrated DNA Technologies (IDT) | Custom | Optimized P3tQ49 DNA template for EXPAR to produce G-quadruplex, primed by P3 cleavage product. This is used in Step 2 to translate the cleavage product into DNAzyme used for Step 3 color development. Template includes a 3'-biotin to prevent unintended extension by Bst 2.0 DNA polymerase during EXPAR. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2. |
| 5x Ribozyme Buffer | Aptagen, LLC | N/A | 5x composition: 600 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM MgCl2, 25 mM DTT. Used in Step 1. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-4. |
| Apta-beaconTM (GQ-EXPAR, TMB) Demonstration Kit | Aptagen, LLC | GQ-EXPAR-TMB | The demo kit showcases the specificity of the colorimetric assay by detecting difficult small molecule targets, theophylline versus caffeine, which only differ by a single methyl group. |
| Bst 2.0 DNA polymerase | New England Biolabs | M0537S | Isothermal amplification polymerase with strand-displacement activity. Part of the Nickase-Polymerase Mix, prepared at 9.375 U/uL. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-1. |
| Buffer 3.1 | New England Biolabs | B6003SVIAL | Combined with 2 uL of 10X Isothermal Amplification Buffer and 27.5 uL of nuclease-free water to produce 1.11X EXPAR Buffer in EXPAR Mix. This product replaces the previously-used B7203SVIAL that was part of the initial system development (same composition except non-recombinant BSA). Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2. |
| Caffeine | Sigma-Aldrich | C0750-100G | Aptamer counter-target (control), prepared with nuclease-free water. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-1. |
| dNTPs | New England Biolabs | N0447S | Part of the EXPAR reaction mixture. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2. |
| EXPAR reaction mixture | Aptagen, LLC | N/A | 0.44 mM dNTPs, 0.38 μM P3tQ49, 0.38 μM QtQ47, 44.44 mM Tris-HCl (pH 8.4), 63.5 mM NaCl, 31.5 mM KCl, 6.35 mM MgCl2, 1.27 mM MgSO4, 6.35 mM (NH4)2SO4, 63.5 μg/ml BSA, 0.0635 % Tween 20. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2. |
| Hemin | Sigma-Aldrich | H9039 | Resuspended in DMF to a final concentration of 25 uM. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 3-1. |
| Isothermal Amplification Buffer | New England Biolabs | B0537SVIAL | Combined with 2 uL of 10x Buffer 3.1 and 27.5 µL of nuclease-free water to produce 1.11x EXPAR Buffer in EXPAR Mix. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2. |
| MgCl2 | Amresco (VWR) | E525-500ML | Hammerhead ribozyme cofactor, necessary for self-cleavage. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 1-3. |
| MJ PTC-100 Thermocycler | MJ Research, Inc. | PTC-100 | Thermocycler to control incubation temperatures. Any thermocycler or hot block can be used. |
| N, N-Dimethylformamide (DMF) | Sigma-Aldrich | 227056-100ML | Used to resuspend hemin and maximize shelf life in freezer. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 3-1. |
| Nickase-polymerase Mix | Aptagen, LLC | N/A | Nt.BstNBI (9.375 units/μL) and Bst 2.0 DNA polymerase (0.5 units/μL). Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 2-1. |
| Nt.BstNBI | New England Biolabs | R0607S | Nicking enzyme to allow continued isothermal amplification. Part of the Nickase-Polymerase Mix, prepared at 0.5 U/uL. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-1. |
| T4 Kinase Buffer | New England Biolabs | B0201SVIAL | Buffer for enzyme necessary to remove cyclic phosphate. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 1-4. |
| T4 polynucleotide kinase | New England Biolabs | M0201S | Removes cyclic phosphate post-cleavage to allow cleavage product to prime isothermal amplification reaction. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as PCR Tubes. |
| Tecan GENios FL | Tecan | Genios-FL TWT | Plate reader to measure absorbance signal from Step 3 results. |
| Theophylline | Sigma-Aldrich | T1633-50G | Aptamer target, prepared with nuclease-free water. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-2. |
| Tris-HCl | American Bioanalytical | AB14043-01000 | Aptamer binding buffer. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 1-4. |
References
- Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).
- Tang, J., Breaker, R. R. Rational design of allosteric ribozymes. Chemical Biology. 4 (6), 453-459 (1997).
- Stoltenburg, R., Reinemann, C., Strehlitz, B. SELEX–A (r)evolutionary method to generate high-affinity nucleic acid ligands. Biomolecular Engineering. 24 (4), 381-403 (2007).
- Liao, A. M., et al. A simple colorimetric system for detecting target antigens by a three-stage signal transformation-amplification strategy. 생화학. 57 (34), 5117-5126 (2018).
- Soukup, G. A., Emilsson, G. A., Breaker, R. R. Altering molecular recognition of RNA aptamers by allosteric selection. Journal of Molecular Biology. 298 (4), 623-632 (2000).
- Van Ness, J., Van Ness, L. K., Galas, D. J. Isothermal reactions for the amplification of oligonucleotides. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (8), 4504-4509 (2003).
- Cheng, X., Liu, X., Bing, T., Cao, Z., Shangguan, D. General peroxidase activity of G-quadruplex-hemin complexes and its application in ligand screening. 생화학. 48 (33), 7817-7823 (2009).
- Nie, J., et al. Reporter-triggered isothermal exponential amplification strategy in ultrasensitive homogeneous label-free electrochemical nucleic acid biosensing. Chemical Communications. 50 (47), 6211-6213 (2014).
- Tabuchi, T., Yokobayashi, Y. Cell-free riboswitches. RSC Chemical Biology. 2 (5), 1430-1440 (2021).
- Ao, Y., et al. Integration of an expression platform in the SELEX cycle to select DNA aptamer binding to a disease biomarker. ACS Omega. 7 (12), 10804-10811 (2022).
