Flowcytometribaseret kvantificering og analyse af myokardie-B-celler

Summary

Her rapporterer vi en protokol til kvantificering og differentiering af myokardie B-lymfocytter baseret på deres placering i det intravaskulære eller endotelrum ved hjælp af flowcytometri.

Abstract

En voksende mængde beviser viser, at B-lymfocytter spiller en vigtig rolle i forbindelse med myokardiefysiologi og myokardietilpasning til skade. Litteraturen rapporterer imidlertid kontrasterende data om forekomsten af myokardie-B-celler. B-celler er rapporteret at være både blandt de mest udbredte immunceller i gnaverhjertet eller at være til stede, men med en markant lavere forekomst end myeloide celler, eller at være ret sjældne. Tilsvarende har flere grupper beskrevet, at antallet af myokardie-B-celler stiger efter akut iskæmisk myokardieskade, men en gruppe rapporterede ingen ændringer i antallet af B-celler i det skadede myokardie. Implementering af en delt, reproducerbar metode til vurdering af forekomsten af myokardiale B-celler er afgørende for at harmonisere observationer fra forskellige forskningsgrupper og dermed fremme udviklingen af undersøgelsen af B-celle myokardieinteraktioner. Baseret på vores erfaring stammer de tilsyneladende kontrasterende observationer, der er rapporteret i litteraturen, sandsynligvis fra det faktum, at murine myokardie B-celler for det meste er intravaskulære og forbundet med det mikrovaskulære endotel. Derfor er antallet af B-celler, der genvindes fra et murinhjerte, udsøgt følsomt over for de perfusionsbetingelser, der anvendes til at rense organet og til den anvendte fordøjelsesmetode. Her rapporterer vi en optimeret protokol, der tager højde for disse to kritiske variabler på en bestemt måde. Denne protokol muliggør reproducerbar, flowcytometribaseret analyse af antallet af murine myokardie-B-celler og giver forskere mulighed for at skelne ekstravaskulære vs. intravaskulære myokardie-B-celler.

Introduction

B-lymfocytter er højt specialiserede immunceller, der spiller en vigtig rolle i både adaptive og medfødte immunresponser¹. Der er to hovedpopulationer af B-celler: en mindre population af B1-celler, der for det meste produceres i embryonalt liv, og en overvejende population af B2-celler, der produceres i voksenlivet i knoglemarven¹. Efter modning i knoglemarven migrerer B-celler til primære og sekundære lymfoide organer. Derfra recirkulerer de kontinuerligt mellem lymfoide organer, der rejser gennem blodkar og lymfekar². B-celler udtrykker specifikke antistoffer på deres overflade, som fungerer som receptorer. Når B-celler støder på et antigen, der binder til deres receptor, kan et aktiverende signal udløses. Aktiverede B-celler migrerer enten til det væv, hvor antigenet blev fundet, eller går tilbage til knoglemarven, hvor de kan modnes til antistofproducerende plasmaceller ^3,4.

For nylig er det blevet værdsat, at hjertet har en betydelig population af B-celler. Undersøgelser af gnavere har vist, at B-celler koloniserer hjertet tidligt under embryonal udvikling⁵, og at myokardieassocierede B-celler for det meste er intravaskulære, naive B2-celler klæbet til endotelet^6,7, med en lille procentdel af B1-celler⁷. Der er stadig mange områder med usikkerhed, men de tilgængelige data indikerer, at B-celler spiller en vigtig rolle både i det naive hjerte og i forbindelse med myokardietilpasning til skade.

Undersøgelser i det naive murinhjerte har vist, at myokardie B-celler ved baseline for det meste er placeret i det intravaskulære rum, klæbet til endotelet (>95% af murine hjerte B-celler viste sig at være placeret i det intravaskulære rum). Disse B-celler viste sig at have genekspressionsmønstre, der adskiller sig fra cirkulerende B-celler isoleret fra det perifere blod. Analyse af naive hjerter fra dyr uden B-celler og syngeneiske kontroller viste, at dyr, der manglede B-celler, havde mindre hjerter og højere udstødningsfraktion⁶. Alt dette tyder på, at B-celler kan modulere myokardievækst og / eller myokardiefunktion, og at ikke kun interstitielle, men også intravaskulære B-celler kan være ansvarlige for sådanne observationer. B-celler viste sig også at modulere fænotypen af myokardieresidente makrofager⁸.

Flere undersøgelser har vist, at B-celler spiller en vigtig rolle i forbindelse med myokardietilpasning til skade 8,9,10,11,12,13. B-celler akkumuleres forbigående i det skadede hjerte, sandsynligvis gennem en CXCL13-CXCR5-afhængig mekanisme^11,13. Derfra fremmer B-celler negativ hjerteremodellering gennem flere mekanismer, der inkluderer cytokinmedieret monocytrekruttering ^9,12. Derudover kan B-celler producere antistoffer mod hjerteproteiner, der kan fremme udvidelsen af hjerteskader og negativ hjerteremodellering gennem flere mekanismer 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25 . B-celler kan også udøve beskyttende virkninger på det skadede hjerte gennem udskillelsen af IL-10¹⁰.

Efterhånden som antallet af grupper, der undersøger B-cellernes rolle i det naive og skadede hjerte, vokser, bliver det mere og mere vigtigt at definere fælles protokoller for korrekt at kvantificere og vurdere myokardie-B-celler og dermed undgå uoverensstemmelser, der allerede er begyndt at dukke op i litteraturen. Indtil videre er B-celler faktisk både rapporteret at være en af de mest udbredte immunceller i gnaverhjertet⁷ og at være til stede med en markant lavere forekomst end myeloide celler ^26,27 eller at være ret sjældne ²⁸. Tilsvarende har flere grupper beskrevet, at antallet af myokardie-B-celler stiger efter akut iskæmisk myokardieskade ^7,9,13, men en gruppe rapporterede ingen ændringer i antallet af B-celler i det skadede myokardium²⁹. Undersøgelser af hjerteimmunceller giver sjældent detaljer om perfusionsbetingelser, og der er ingen konsensus om fordøjelsesbetingelserne. Da en stor del af B-cellerne i gnaverhjertet er intravaskulære, og ekstraktion af immunceller fra myokardiet er stærkt afhængig af den anvendte fordøjelsesmetode, kan de forskelle, der rapporteres i litteraturen, være resultatet af forskelle i organperfusion og vævsfordøjelse.

Præsenteret her er en detaljeret metode til flowcytometribaseret kvantificering af murinmyokardie B-celler, der maksimerer udbyttet af B-cellegendannelse ved at optimere perfusions- og fordøjelsesbetingelser og tillader diskrimination af intravaskulære vs. ekstravaskulære myokardiale B-celler⁶. Denne protokol er en tilpasning og optimering af andre lignende protokoller, der skelner mellem intravaskulære og interstitielle immunceller 28,30,31.

I denne protokol standardiserer vi myokardieperfusion for at eliminere B-celler, der flyder i det intravaskulære rum uden at fjerne biologisk relevante B-celler, der klæber til det mikrovaskulære endotel. Ved at bygge videre på tidligere protokoller, der har beskrevet brugen af intravenøs injektion af antistoffer til at skelne intravaskulære fra interstitielle immunceller³², og drage fordel af det faktum, at B-celler udtrykker overflademarkøren B220³³, demonstrerer vi, hvordan man skelner mellem intravaskulære vs. ekstravaskulære myokardie-B-celler gennem intravaskulær injektion af et B220-specifikt antistof umiddelbart før dyreofring og hjerteperfusion. Denne protokol er relevant for forskningen fra enhver videnskabsmand, der er interesseret i at inkludere analysen af myokardiale B-celler i det naive og skadede hjerte. Den udbredte implementering af denne protokol vil reducere uoverensstemmelser mellem forskergrupper, vil muliggøre analyse af ændringer i de intravaskulære og ekstravaskulære myokardie-B-cellepuljer og dermed styrke udviklingen af opdagelser inden for hjerteimmunologi.

Sammenfattende repræsenterer protokollen en optimeret arbejdsgang til at kvantificere og analysere myokardiale B-celler via flowcytometri og samtidig skelne mellem celler placeret i det ekstravaskulære rum og det intravaskulære rum.

Protocol

Alle eksperimenter beskrevet i dette manuskript blev udført med godkendelse af IACUC ved Johns Hopkins University School of Medicine. 1. præparater Forbered FACS-bufferen som beskrevet i tabel 1. Sørg for, at der er nok CO2 til at aflive dyrene. Forbered dissektionsrummet (placer bænkpuden og placer tape og dissektionsværktøjer i nærheden). Mærk de 15 ml rør, læg 3 ml HBSS med calcium og magnesium i …

Representative Results

Når erhvervelsen er afsluttet, og alle hændelser er indsamlet, skal dataene analyseres i henhold til standard flowcytometripraksis. Analysens fokus vil variere afhængigt af det individuelle mål for hvert eksperiment. I dette tilfælde blev kvantificering af intravaskulære og ekstravaskulære B-celler forfulgt, og det blev udtrykt som antallet af celler pr. Mg væv. Når du bruger et spektralcytometer, anbefales det at starte analysen med en indledende gating for at fjerne snavs med størr…

Discussion

En voksende mængde beviser indikerer, at B-celler spiller en vigtig rolle i forbindelse med myokardiefysiologi og myokardieombygning / tilpasning til skade 7,8,9,10,11,12,13,36. Flowcytometri er et fremragende værktøj til at studere immuncellepopulatione…

Materials

Alexa Fluor 700 anti-mouse/human CD11b Antibody	101222	BioLegend	100 µg 200 µL
(CellTreat 29481) Cell Strainer, 40 µm, Blue	QBIAP303	Southern Labware
0.5 mL Natural Microcentrifuge Tube	1605-0000	SealRite, USA Scientific
0.9% Sodium Chloride Injection, USP	114-055-101	Quality Biological	0.90%
1.5 mL Natural Microcentrifuge Tube	1615-5500	SealRite, USA Scientific
10 µL Graduated TipOne Filter Tips	11213810	USA Scientific
1000 µL Graduated TipOne Filter Tips	11267810	USA Scientific
15 mL Centrifuge Tube, Plug Seal Cap, Polypropylene, RNase-/DNase-free	430052	Corning
1-Way Stop Valve, Polycarbonate	SVPT951	ECT Manufacturing
2,2,2-Tribromoethanol	T48402	Sigma-Aldrich
200 µL Graduated TipOne Filter Tips	11208810	USA Scientific
3-Way Stop Valve, Polycarbonate	SVPT953	ECT Manufacturing
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube, 12 x 75 mm style	352054	Falcon, a Corning Brand
50 mL Centrifuge Tube, Plug Seal Cap, Polypropylene, RNase-/DNase-free	430290	Corning
ACK (Ammonium-Chloride-Potassium) Lysing Buffer	118-156-101	Quality Biological	Osmolality: 290 + or -5% mOsm/Kg H20
Adapter 4x50ml, for 250 mL rectangular bucket in Rotor A-4-63	5810759005	Eppendorf
Adapter for 15 mL Centrifuge Tubes, 9 Tubes per Adapter, Conical Bottom for use with Rotor Model A-4-62	22638289	Eppendorf
Adapter for 15 round-bottom tubes 2.6 – 7 mL, for 250 mL rectangular bucket in Rotor A-4-62	22638246	Eppendorf
Aluminum Foil 12 in x 75' Roll .0007	UPC 109153	Reynolds Wrap
Anesthesia Induction Chamber – Mouse	RWD-AICMV-100	Conduct Science
BD Luer Slip Tip Syringe with attached needle 25 G x 5/8 in., sterile, single use, 1 mL	309626	BD Becton, Dickinson and Company
Brandzig Ultra-Fine Insulin Syringes 29G 1cc 1/2" 100-Pack	CMD 2613	Brandzig
Brilliant Violet 421 anti-mouse CD19 Antibody	115537	BioLegend	50 µg/mL
CAPS for Flow Tubes w/strainer mesh 35 µm, Dual position for 12 x 75 mm tubes, sterile	T9009	Southern Labware
Carbon Dioxide USP E CGA 940	CD USPE	AirGas USA
Cole-Parmer Essentials Low-Form Beaker, Glass, 500 mL	UX-34502-46	Cole-Parmer
Collagenase 2	LS004176	Sigma-Aldrich
Connector brass chrome plated 1/4" female NPT x 1/4" barb	Y992611-AG	AirGas USA
Cytek Aurora Flow Cytometer		Cytek Biosciences
Diss 1080 Nipple 1/4 BARB CP	M-08-12	AirGas USA
DNase I – 40,000 U	D4527	Sigma-Aldrich
Easypet 3 – Electronic Pipette Controller	4430000018	Eppendorf
Electronic Balance, AX223/E	30100606	Ohaus Corp.
Eppendorf 5810R centrifuge	5810R	Eppendorf
Eppendorf Research plus 1-channel variable pipettes		Eppendorf
FlowJo 10.8.1		BD Becton, Dickinson and Company
GLACIERbrand, triple density Ice Pan (IPAN-3100)	Z740287	Heathrow Scientific
HBSS (1x) – Ca2+ [+] Mg2+ [+]	14025076	gibco	1x
Hyaluronidase	H3506	Sigma-Aldrich
Kelly Hemostats, Straight	13018-14	Fine Science Tools
Luer Slip Syringe sterile, single use, 20 mL	302831	BD Becton, Dickinson and Company
M1 Adj. Reg 0-100 PSI/CGA940	M1-940-PG	AirGas USA
McKesson Underpads, Moderate	4033-CS150	McKesson
Navigator Multi-Purpose Portable Balance	NV2201	Ohaus Corp.
PBS pH 7.4 (1X) Ca2+ [-] Mg2+ [-]	10010023	gibco	1x
PE anti-mouse/human CD45R/B220 Antibody	103208	BioLegend	200 µg/mL
PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse CD45 Antibody	103132	BioLegend	100 µg 500 uL
Petri dish, Stackable 35 mm x 10 mm Sterile Polystyrene	FB0875711YZ	Fisher Scientific
Pkgd: Diss 1080 Nut/CO2/CO2-02	M08-1	AirGas USA
Powerful 6 Watt LED Dual Goose-Neck Illuminator	LED-6W	AmScope
PrecisionGlide Needle 25 G x 5/8 (0.5 mm x 16 mm)	305122	BD Becton, Dickinson and Company
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) Clone 2.4G2 (RUO)	553141	BD Becton, Dickinson and Company Biosciences	0.5 mg/mL
R 4.1.1		The R Foundation
Razor Blades	9501250000	Accutec Blades Inc
Regulator analytical two stage 0-25 psi delivery CGA320 3500 psi inlet	Y12244A320-AG	AirGas USA
Rotor A-4-62, incl. 4 x 250 mL rectangular buckets	Rotor A-4-62	Eppendorf
Serological pipette, plugged, 10 mL, sterile, non-pyrogenic/endotoxin-free, non-cytotoxic, 1 piece(s)/blister	86.1254.001	Sarstedt AG & Co KG
Sigma label tape	L8394	Sigma-Aldrich
SpectroFlo 3.0.0		Cytek Biosciences
Spex VapLock Luer Fitting, PP, Straight, Male Luer Lock x 1/8" Hose Barb; 1/EA	MTLL230-6005	Spex
Std Wall Lab Tubing, Size S2, Excelon, 1/8" ID x 3/16" OD x 1/32" Wall x 50' Long	CG-730-003	Excelon Laboratory
Syringe PP/PE without needle, 3 mL	Z683566	Millipore Sigma
Syringe pump	55-1199 (95-240)	Harvard Apparatus
Thomas 3-Channel Alarm Timer TM10500	9371W13	Thomas Scientific
Tube Rack, 12 positions, 6 for 5.0 mL and 15 mL tubes and 6 for 25 mL and 50 mL tubes, polypropylene, numbered positions, autoclavable	30119835	Eppendorf
Tube Rack, 12 positions, for 5.0 mL and 15 mL tubes, polypropylene, numbered positions, autoclavable	30119827	Eppendorf
TYGON R-3603 Laboratory Tubing, I.D. × O.D. 1/4 in. × 3/8 in.	T8913 (Millipore Sigma)	Tygon, Saint-Gobain
Vortex-Genie 2	SI-0236	Scientific Industries, Inc.
VWR Dissecting Forceps with Guide Pin with Curved Tips	89259-946	Avantor, by VWR
VWR Dissecting Scissors, Sharp Tip, 4½"	82027-578	Avantor, by VWR
VWR Incubating Orbital Shaker, Model 3500I	12620-946	Avantor, by VWR
Zombie Aqua Fixable Viability Kit	423102	BioLegend