Kombinationen af laserporation og mikroelektrodearrays (MEA) tillader handlingspotentialelignende optagelser af dyrkede primære og stamcelleafledte kardiomyocytter. Bølgeformformen giver overlegen indsigt i testforbindelsers virkemåde end standardoptagelser. Det forbinder patch-clamp og MEA-udlæsning for yderligere at optimere cardio-sikkerhedsforskning i fremtiden.
Livstruende lægemiddelinduceret hjertearytmi er ofte forud for langvarige hjertehandlingspotentialer (AP), almindeligvis ledsaget af små proarytmiske membranpotentialeudsving. Formen og tidsforløbet af den repolariserende fraktion af AP kan være afgørende for tilstedeværelsen eller fraværet af arytmi.
Microelectrode arrays (MEA) giver nem adgang til kardiotoksiske sammensatte effekter via ekstracellulære feltpotentialer (FP). Selvom det er et kraftfuldt og veletableret værktøj inden for forskning og hjertesikkerhedsfarmakologi, tillader FP-bølgeformen ikke at udlede den originale AP-form på grund af det ekstracellulære optagelsesprincip og den resulterende iboende vekselstrømsfiltrering (AC).
En ny enhed, der er beskrevet her, kan gentagne gange åbne membranen af kardiomyocytter dyrket oven på MEA-elektroderne på flere dyrkningstidspunkter ved hjælp af en meget fokuseret nanosekundlaserstråle. Laserporationen resulterer i transformation af det elektrofysiologiske signal fra FP til intracellulære lignende AP’er (laserinduceret AP, liAP) og muliggør optagelse af transcellulære spændingsafbøjninger. Denne intracellulære adgang giver en bedre beskrivelse af AP-formen og en bedre og mere følsom klassificering af proarytmiske potentialer end almindelige MEA-optagelser. Dette system er en revolutionerende udvidelse af de eksisterende elektrofysiologiske metoder, der muliggør nøjagtig evaluering af kardiotoksisk virkning med alle fordele ved MEA-baserede optagelser (lette, akutte og kroniske eksperimenter, signaludbredelsesanalyse osv.).
Det elektriske bidrag fra et hjerteslag skyldes et komplekst og præcist timet samspil mellem mange hjertekanaler og transportører samt den præcist indstillede udbredelse af elektriske signaler gennem myokardiet1. Ændring af disse tæt koordinerede mekanismer (f.eks. brug af lægemidler) kan resultere i alvorlige konsekvenser for hjertets funktion (dvs. livstruende arytmi)2,3. Arytmier er defineret som uregelmæssige hjerteslag, der ændrer hjertets normale rytme, hvilket kan have livstruende konsekvenser. De kan være forårsaget enten af nedsat initiering af en bølge af hjerte-excitation eller ved unormal udbredelse af hjerte-excitation4, hvilket igen resulterer i en dysfunktion af hjertets pumpemekanisme.
Mange meget potente lægemiddelkandidater skal udelukkes fra yderligere undersøgelser i den tidlige lægemiddeludviklingsfase på grund af deres (pro-) arytmiske potentiale 2,3. De modulerer vigtige hjertekanaler (f.eks. den humane ether-a-go-go-relaterede genkanal [hERG]), der er ansvarlige for normal dannelse og afslutning af hjertevirkningspotentiale samt efterfølgende signaludbredelse5.
Farmaceutiske virksomheder bruger rutinemæssigt patch-clamp-målinger eller mikroelektrodearrays (MEA) til at undersøge potentielle kardiotoksiske off-target-effekter induceret af lægemiddelkandidater. Patch-clamp-optagelser gør det muligt at dechiffrere stoffernes indvirkning på hjerteionkanaler og analysere det transcellulære hjertehandlingspotentiale med høj spatio-temporal opløsning 6,7. Ulemperne ved denne teknik inkluderer imidlertid lav gennemstrømning med manuel patch-clamp og begrænset anvendelighed af automatisering på grund af afhængigheden af denne metode på celler i suspension. Desuden kan kroniske virkninger ikke undersøges på grund af metodens invasivitet. Endelig studeres typisk kun enkeltceller samtidigt i stedet for hele hjertesynkytium, hvilket gør det umuligt at adressere information om signaludbredelse.
Spændingsfølsomme farvestoffer er værdifulde til ikke-invasiv undersøgelse af hjerteaktionspotentialer og lægemiddelinducerede arytmier8. De tillader undersøgelse af både enkeltcelle- og syncytiumaktivitet. Ulemper ved denne metode er cytotoksiske virkninger af enten farvestofferne i sig selv eller af reaktionsproduktet under belysning. De bruges til akutte eksperimenter og er næppe anvendelige til langtidsundersøgelser 9,10,11. Spændingsfølsomme proteiner som alternativer har gjort betydelige fremskridt i løbet af de sidste par år med hensyn til anvendelighed og følsomhed, men kræver genetisk modifikation af cellerne af interesse og mangler høj tidsmæssig opløsning sammenlignet med elektrofysiologiske teknikker12.
Oplysninger fra det seneste CiPA-initiativ13 siger, at MEA’er i vid udstrækning anvendes i hjertesikkerhedsscreeninger som en alternativ elektrofysiologisk tilgang, da de repræsenterer et kraftfuldt og veletableret værktøj til at undersøge hjertefunktion og sikkerhedsfarmakologi. Kardiomyocytter dyrkes som et syncytium direkte oven på chipsene, og ekstracellulære feltpotentialer (FP’er) registreres ikke-invasivt via substratintegrerede mikroelektroder. Dette optagelsesprincip gør det muligt at udføre øgede gennemstrømningsscreeninger over flere dage, hvilket gør dem velegnede til farmaceutisk forskning i kroniske virkninger. Den resulterende FP-bølgeform er et derivat af den intracellulære AP14. Parametre som slaghastighed, amplituden af den indledende del af FP og FP-varighed er let tilgængelige15. Andre væsentlige kriterier såsom differentieringen mellem forlængelse og triangulering af FP (en vigtig markør for proarytmi16,17) er utilgængelige på grund af teknikkens AC-filtreringseffekt. Desuden overses detektering af andre små proarytmiske begivenheder såsom tidlige og forsinkede efterdepolariseringer (henholdsvis EAD og DAD) ofte let på grund af deres lille amplitude.
Her beskriver vi en metode til at få adgang til det intracellulære membranpotentiale ved at åbne membranen af kardiomyocytter. IntraCell-enheden (i det følgende benævnt intracellulær optageenhed) tillader gentagne membranåbninger af kardiomyocytter dyrket oven på MEA-elektroderne ved hjælp af en meget fokuseret nanosekundlaserstråle via et specifikt fysisk fænomen (overfladeplasmonresonans)18. Som et resultat overgår optagelsen fra en almindelig FP til en intracellulærlignende AP (laserinduceret AP, liAP). Protokollen viser, hvordan dette giver adgang til kinetiske aspekter af bølgeformen, der ikke let kan fanges ved at analysere FP’er. Denne metode repræsenterer en bro mellem traditionelle intracellulære patch-clamp og MEA-optagelser. Teknologien er derfor en stærk forlængelse af de nuværende metoder til vurdering af hjertesikkerhed.
Denne innovative metode demonstrerer en ny måde at undersøge in vitro den farmakologiske modulering af hjertevirkningspotentialet under anvendelsen af kardioaktive farmakologiske værktøjsforbindelser.
Klassiske MEA-optagelser tillader FP-optagelser, som er afledt af hjerte-AP14. Denne indirekte registrering forvirrer tidsforløbet for de- og repolariseringen og eliminerer derved væsentlige egenskaber ved AP. Selvom den transcellulære spændingsændring af en AP typisk når værdier på ca. 100 mV, forbliver den samlede FP-amplitude sammenlignelig lav med spidsamplituder mellem flere 100 μV og lave encifrede mV-værdier. På grund af optagelsesprincippet er den repolariserende fase lille; i mange tilfælde er det blot påviseligt og ofte af uklar form, hvilket gør det vanskeligt at definere afslutningen på rammeprogrammet. Åbningen af cellemembranen giver os mulighed for at få adgang til den intracellulære spænding og derved afdække hjerte-AP’s tidsforløb. Der er flere fordele ved denne optagelsesmetode sammenlignet med FP-optagelser. For det første er signalamplituden mere fremtrædende, hvilket giver et overlegent signal-støj-forhold. For det andet resulterer bølgeformen i bedre påvisning af repolariseringen. For det tredje bidrager formen af repolariseringsfasen med indsigt i testforbindelsens virkningsmåde, der tilvejebringes af signalafslapningens stejlhed. Og endelig giver denne metode en forbedret følsomhed til at detektere kritiske bivirkninger, hvilket fremgår af optagelseseksemplet vist i figur 6 for forekomsten af EAD’er i liAP, men ikke i FP.
Indtil videre er der to måder at få adgang til den intracellulære AP. Den første opnås ved elektroporation26,27. Her kan korte og stærke spændingsimpulser, der påføres via optageelektroderne, åbne cellemembranen28. Den anden mulighed er membranåbningen via en laserpuls, der gør brug af et fysisk fænomen ved navn overfladeplasmonresonans, som demonstreret her. En af fordelene i forhold til elektroporation er den øgede sandsynlighed for på hinanden følgende åbninger. På grund af den meget fokuserede laserplet (1-3 μm) er denne effekt meget lokalt begrænset til elektroden af interesse. Interessant nok ændrede indledningen af liAP ikke signaludbredelsen af det dyrkede syncytium. Dette indikerer, at selvom celleintegriteten er beskadiget, synes kardiomyocytterne ikke at depolarisere via hullet i membranen.
Der er begrænsninger for denne metode. Ligesom med elektroporation varer membranåbningen i de fleste tilfælde ikke over hele eksperimentalforløbet. De minimale effekt- og varighedsindstillinger for laserpulsen, der kræves for stabil åbning af den specifikke celletype af interesse, skal defineres uafhængigt inden forsøgene. Vi fandt (ikke vist), at parametrene varierer drastisk mellem forskellige celletyper (i vores tilfælde flere hiPS-afledte og primære kardiomyocytter). Dette undgår unødvendig stress på cellerne under det sammensatte testeksperiment og resulterer i mere pålidelige og reproducerbare data. Det er af afgørende betydning at justere z-aksen for at give et klart fokus på cellerne og elektroderne. Et ufokuseret kamerabillede giver efter i et laserpunkt placeret på et suboptimalt niveau, hvilket potentielt resulterer i manglende evne til at åbne cellemembranen. Selv med de bedst justerede parametre er liAP-effekten forbigående, og amplituden reduceres over tid. Desuden varierer adgangen til cellernes intracellulære rum mellem liAP-induktioner, både inden for på hinanden følgende åbninger ved samme elektrode og mellem elektroder. Dette resulterer i høj variabilitet af liAP-amplituden. Årsagen er endnu ikke fuldt ud forstået. Mulige forklaringer inkluderer mekaniske problemer såsom en drift af laserfokus eller forskellig subcellulær lokalisering af membranåbningen. Dette gør analysen af amplitudeeffekter af testforbindelser kompliceret på dette tidspunkt. Registrering af elektrisk aktivitet af et MEA-system kræver også filtrering med højt pass for at kompensere for uundgåelig baseline-drift. Selvom denne filtrering i det system, der blev brugt her, var indstillet til 0,1 Hz (den laveste filterindstilling, der var tilgængelig for dette system), var filtreringseffekter under plateaufasen stadig synlige, hvilket resulterede i en langsom tendens til spændingsafbøjningen mod basislinjen under plateaufasen af hjerte-AP. Dette er især problematisk med meget lange underliggende AP’er som de iPSC-afledte iCell-kardiomyocytter2 , der anvendes her, som allerede genererer AP >700 ms under kontrolforhold. Brugen af systemer med lavere filtrering kan bedre bevare formen på AP og give endnu bedre adgang til tidsforløbet af repolariseringsfasen.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne takke Foresee Biosystems for at låne IntraCell-systemet under undersøgelserne. De vil også gerne takke Hae In Chang for teknisk assistance. Dette arbejde har modtaget støtte fra EU’s Horizon 2020’s forsknings- og innovationsprogram under tilskudsaftale nr. 964518 (ToxFree), fra EU Horizon Europe European Innovation Council Programme, projekt SiMulTox (tilskudsaftale nr. 101057769) og fra statsministeriet i Baden-Württemberg for økonomi, arbejde og turisme.
1 well MEA chip | Multi Channel Systems MCS GmbH | 890301 | |
6 well MEA chip | Multi Channel Systems MCS GmbH | 7600069 | |
DMSO | Merck KGaA | 20-139 Sigma-Aldrich |
solvent for drugs |
Dofetilide | ALOMONE LABS ISRAEL HEADQUARTERS |
D-100 | Drug-Measurement |
dPBS | Fisher Scientific GmbH | 12037539 | Coating |
E4031 | ALOMONE LABS ISRAEL HEADQUARTERS |
E-500 | Drug-Measurement |
Falcon | Fisher Scientific GmbH | 10788561 | |
FB Alps version 0.5.005 | Foresee Biosystems | ||
Fibronectin | Merck KGaA | 11051407001 | Coating |
iCell cardiomyocytes | FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. (FCDI) |
C1016 | |
IntraCell | Foresee Biosystems | ||
IntraCell | Foresee Biosystems | ||
Isopropanol | Carl Roth GmbH + Co. KG | CN09.1 | For cleaning of MEA contact pads |
Maintenance Medium | FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. (FCDI) |
#M1003 | For cell-culture |
MC_Data Tool | Multi Channel Systems MCS GmbH | Data export | |
MC_Rack | Multi Channel Systems MCS GmbH | MEA recording | |
MEA 2100 – 2×60 – system | Multi Channel Systems MCS GmbH | 890485 | For MEA-recordings |
Nifedipine | Merck KGaA | N7634 Sigma-Aldrich |
Drug-Measurement |
Plating Medium | FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. (FCDI) |
M1001 | For cell-culture |
Tergazyme | VWR International, LLC | 1304-1 | cleaning of MEAs |