Insekter har et optimalt miljøtemperaturområde som de søker å holde seg innenfor, og mange eksterne og interne faktorer kan endre denne preferansen. Her beskriver vi en kostnadseffektiv og enkel metode for å studere temperaturvalg, som gjør at insekter fritt kan vise sin naturlige oppførsel.
De fleste insekter og andre ektotermer har et relativt smalt optimalt temperaturvindu, og avvik fra deres optima kan ha betydelige effekter på deres kondisjon, så vel som andre egenskaper. Følgelig søker mange slike ektotermer sitt optimale temperaturområde. Selv om temperaturpreferanser av mygg og andre insekter har blitt godt studert, utføres det tradisjonelle eksperimentelle oppsettet ved hjelp av en temperaturgradient på en aluminiumoverflate i et svært lukket rom. I noen tilfeller begrenser dette utstyret mange naturlige atferder, for eksempel å fly, noe som kan være viktig i preferansevalg.
Målet med denne studien er å observere insektpreferanse for lufttemperatur ved å bruke et tokammerapparat med tilstrekkelig rom for flyging. De to kamrene består av uavhengige temperaturkontrollerte inkubatorer, hver med stor blenderåpning. Inkubatorene er forbundet med disse åpningene ved hjelp av en kort akrylbro. Inne i inkubatorene er det to nettede bur, koblet sammen via åpningene og broen, slik at insektene kan fly fritt mellom de forskjellige forholdene. Akrylbroen fungerer også som en temperaturgradient mellom de to inkubatorene.
På grunn av det romslige området i buret og enkel konstruksjon, kan denne metoden brukes til å studere enhver liten ektoterm og / eller manipulasjon som kan endre temperaturpreferanse, inkludert sensorisk organmanipulering, diett, tarmflora og endosymbiont tilstedeværelse på biosikkerhetsnivå 1 eller 2 (BSL 1 eller 2). I tillegg kan apparatet brukes til studier av patogeninfeksjon ved bruk av ytterligere inneslutning (f.eks. inne i et biosikkerhetsskap) ved BSL 3.
Organismer kan leve og reprodusere bare innenfor deres termiske toleranseområde. Ettersom miljøtemperaturen varierer på grunn av årstider og global oppvarming, må artene tilpasse seg og reagere tilsvarende for å sikre overlevelse. Dette inkluderer ektotermer, hvor kroppstemperaturen er i likevekt med miljøet1. Derfor har hvert insekt sitt eget optimale miljøtemperaturområde som de søker å holde seg innenfor2.
Temperatur er en av de viktige faktorene som brukes til å forutsi fordelingen og rekkevidden av insekter 3,4,5, observere patogen-insektforhold6,7 og effekten av eksterne faktorer på egnetheten til ektotermer som deres voksne levetid, fecundity og fôringshastighet 8,9.
Tidligere studier har undersøkt den foretrukne temperaturen til ektotermer med forskjellige oppsett. Det vanligste er å bruke en stor aluminiumsblokk enten med et avkjølt eller oppvarmet vannbad10, et isbad og programmerbart varmeelement11, kulde- og varmeplater12,13, termiske regulatorplater 14,15 eller en varmepakke og ispakke 16 i hver ende for å skape en temperaturgradient. I tillegg har andre studier også brukt en temperaturgradientinkubator for å studere veksten av utvalgte bakterier17 og montert en aluminiumstang på en termoelektrisk enhet (oppvarmet og avkjølt i enden) for å observere termisk preferanse for Drosophila melanogaster18,19.
Den alternative metoden som foreslås her har imidlertid betydelige fordeler for visse insektapplikasjoner. For det første krever andre løsninger komplett konstruksjon fra bunnen av med grunnleggende materialer, inkludert aluminiumsplater, konstruksjon av akrylkamre for insekter, og ofte et kameraoppsett og spesialprogramvare; Dette kan være dyrt og tidkrevende å sette opp. For det andre er mange alternative apparater avhengige av en temperaturgradient på en overflate (i motsetning til lufttemperatur). Følgelig er kammeret der insektene studeres ofte svært smalt (f.eks. 24 cm lange gradienter med bare 2 cm bredde og 1 cm dybde16), noe som kan forhindre naturlig atferd, for eksempel flyging, som er avgjørende for insekters normale mobilitet og dermed avgjørende for å velge en foretrukket temperatur. Noen studier måler lufttemperaturen; Valget innebærer imidlertid fortsatt å telle antall mygg som lander på Peltier-elementene i motsetning til insekter som flyr fritt i burene20.
I denne studien beskriver vi et enklere oppsett, som bruker minimalt modifisert standardutstyr og gir insekter tilstrekkelig plass til å fly og navigere relativt uhindret i et kolonivedlikeholdsbur i standardstørrelse. Videre, i stedet for å stole på en gradient, bruker protokollen to relativt store seksjoner med konsistent intern temperatur, noe som muliggjør naturlig roaming av insektene ved deres foretrukne temperatur og en enkel binær scoring. Derfor gir apparatet og protokollen beskrevet her en billig og enkel måte å studere myggtemperaturpreferanse i en mindre obstruktiv og mer realistisk setting.
Protokollen innebærer utarbeidelse av insekter før eksperimentet etterfulgt av tokammerapparatoppsettet. Ytterligere trinn inkluderer å plassere insekter i apparatet for å tillate valg av temperatur og scoring av resultater. For en illustrasjon av metoden her, valgte vi optimal (standard oppdrett) temperatur på insektene, 27 °C for Aedes aegypti, 25 °C for Drosophila melanogaster, og en høyere frastøtende temperatur for begge insektartene, henholdsvis 30 °C og 28 °C. Insekter får 30 minutter for å velge et foretrukket kammer. Denne tiden ble funnet å være tilstrekkelig, og en lengre varighet endret ikke resultatene; Dette kan imidlertid utvides avhengig av art/temperatur/andre variabler etter behov.
Studien beskriver en ny metode for å observere temperaturpreferansen hos mygg. I denne metoden slippes mygg ut i et rør som er koblet til to inkubatorer med uavhengig kontrollerbare temperaturer. På denne måten får myggene fritt velge mellom to temperaturer uten å forstyrre deres naturlige oppførsel og mekanisme for å uttrykke dette valget (f.eks. Å fly).
Vårt første representative eksperiment brukte myggens optimale temperatur på 27 °C i begge kamrene. Under repetisjonene av dette eksperimentet ble mygg observert å være fritt flygende mellom begge burene i hele 30 minutter, og i alle replikasjoner var det nesten like mange i hvert av de to kamrene. Dette bekreftet den eksperimentelle intensjonen om å la myggene muligheten til fritt å velge mellom bur mens de viser sin naturlige oppførsel (flyr). Omvendt benyttet det andre representative eksperimentet den attraktive optimale temperaturen på 27 ° C i ett kammer og en suboptimal og dermed avstøtende temperatur på 30 ° C i det andre kammeret. Som forventet valgte myggene konsekvent det optimale temperaturkammeret med høy betydning, selv når vi byttet inkubatorene for å unngå skjevhet.
Vi testet også oppsettet for et annet insekt, D. melanogaster (bananfluer), som representerer en annen ektoterm modellorganisme. Det ene kammeret ble satt til optimal temperatur på D. melanogaster, 25 °C, og det andre ble satt til 3 °C høyere, 28 °C. I likhet med mygg favoriserte fruktfluer også sin optimale temperatur og unngikk det varmere kammeret. Dette viser at protokollen er egnet for en rekke ektotermer.
Beskrivelse av kritiske trinn i protokollen
Det viktigste kritiske trinnet i protokollen er insekthåndtering, da det genererer muligheten for at insekter rømmer. Dette kan forhindres ved å fastslå at det ikke er hull som er store nok til rømning i burene som brukes, at gummibåndene/buntebåndene som brukes til å feste nettinghylsene til broen er tette, og at dekselet til insektinnsettingshullet på broen er forsvarlig festet og forseglet.
Det er også viktig å sikre at insekter ikke rømmer før eller etter forsøket, spesielt når insektene er nødvendige for nedstrøms eksperimentering eller senere tidspunkter for ulike temperaturvalg. Dette kan gjøres ved å bedøve insektene før de plasseres i akrylbroen (ved å bruke is til Drosophila og CO 2 for mygg) og slippe CO2 inn i broen for å slå ned insektene etter forsøkene, før beregning. Bruken av CO2 er ideell for mygg siden det ikke vil påvirke atferdsresultatene21. Hos fluer kan eksponering for CO2 endre flygeatferd23, og det anbefales derfor å bruke is22.
Telling av insekter er også et kritisk skritt for å sikre at antall insekter er like før og etter forsøket for nøyaktige resultater. For å gjøre dette anbefaler vi bruk av en CO2 penn når eksperimentet er fullført for å slå ned insektene som befinner seg i broen. Dette vil bidra til å flytte insekter til hver side av kammeret, og dermed redusere antall rømninger. Vi fremhever også i protokollen at insekter kan fanges i ermene på burene under burseparasjon; Sørg derfor for at disse kontrolleres grundig under telling.
Potensielle modifikasjoner og feilsøking av teknikken
Hovedproblemet med denne teknikken er det fleksible nettverket av burhylsene som resulterer i hull eller gjemmesteder og dermed insektflukt eller fangst. Det er noen potensielle modifikasjoner, om nødvendig, for å forbedre teknikken. Vi foreslår at du bruker to eller flere gummibånd for å sikre at broen er forsvarlig festet mellom kamrene uten å etterlate potensiell plass til insektene (løst nett skaper et gjemmested for insekter). Vi anbefaler også spesiell forsiktighet for å trekke maskehylsen stramt, som beskrevet i trinn 2.6, når du monterer apparatet.
Inkubatorer med liten formfaktor oppvarmes vanligvis bare (dvs. har ingen aktiv kjøling), slik tilfellet var for inkubatorene som brukes her. Følgelig vil bruk av temperaturer rundt eller under romtemperaturen kreve at eksperimentet utføres i et kaldt rom for å sikre at temperaturene som er satt for inkubatorene, vil gå så lave som ønsket.
I tillegg kan dette oppsettet også brukes til BSL 3, hvor det er behov for et klasse tre biosikkerhetsskap (hanskeboks). I dette tilfellet må hanskerommet være stort nok til å passe til hele apparatet. Eksperimentet beskrevet i denne protokollen er ideelt for eksperimenter i et hanskerom fordi alt som kreves vil være inneholdt i hanskerommet, og viktigere, muligheten for at insekter rømmer er minimal.
Til slutt er det nok plass i inkubatorene til å legge til eksternt lys eller en fuktighetskilde uten å påvirke insekter i burene. Avhengig av insektart eller eksperimentell design, kan en LED-lampe med 1 cm tykkelse enkelt plasseres på toppen av buret inne i en eller begge inkubatorer. Å gi lys til begge og tilby et temperaturvalg kan være en mer realistisk protokoll for noen lysfølsomme eksperimentelle design, eller bare å gi lys (eller fuktighet) til ett kammer er en mulig modifikasjon av protokollen for å vurdere lys / fuktighetsvalg.
Fordeler med denne teknikken i sammenheng med dual choice temperaturpreferanseanalyser
Metoden beskrevet her presenterer et alternativ til den tradisjonelle temperaturgradientmetoden beskrevet i tidligere studier10,13,14,16. I de fleste av disse studiene brukes en stor horisontal aluminiumsblokk med termisk gradient, mens mekanismen for å generere denne gradienten varierer, inkludert oppvarming / kjøleblokker, vannbad, etc. I disse tilfellene produseres temperaturgradienten på overflaten av aluminiumblokken (i stedet for lufttemperaturen i et bur). Følgelig begrenser de fleste (men ikke alle) alternative teknikker flyevnen til insekter mer enn denne protokollen. Her kan insekter fly relativt fritt mellom burene, noe som gir et mer realistisk uttrykk for naturlig atferd i valg. Det ville til og med være mulig å oppskalere dette eksperimentelle apparatet ved hjelp av større bur og inkubatorer, for eksempel for større insekter.
I tillegg til den naturlige atferdsfordelen, demonstrerer vi også svært høy temperaturuniformitet i de to kamrene, noe som muliggjør enkel scoring og et klart utvalg av to store enkelttemperaturkamre. Bruken av et binært storkammerdesign som dette kan redusere støy i dataene, der for eksempel på et gradientapparat vil enhver tilfeldig bevegelse av insektene endre posisjonen på gradienten og dermed deres oppfattede temperaturpreferanse.
Teknikken beskrevet her er også veldig enkel og lav pris. Denne teknikken trenger ikke ekstra apparater for å stille inn temperaturene (dvs. et vannbad10 og / eller en kokeplate 11,12,13,14,15), ikke noe spesialutstyr foruten et kuttet akrylrør og borede hull, og ingen kamera 18,19 eller sofistikert programvare 19 for analyse. Slike komponenter som brukes i andre teknikker kan være dyre og / eller krever betydelig kompetanse og testing for å starte eksperimenter.
Denne teknikken kan også replikeres med forskjellige enheter som bruker batterier hvis det ikke er ekstern strømforsyning, noe som gjør systemet ideelt for å utføre eksperimenter i feltet. Videre kan det samme apparatet modifiseres litt for å studere andre binære valgpreferansesituasjoner, for eksempel lys mot mørk, høy / lav luftfuktighet, etc., enten i laboratoriet eller feltet.
Apparatet i full størrelse i protokollen er betydelig mindre enn temperaturgradientoppsett, noe som gjør det lettere å passe inn i en BSL 3-hanskeboks som beskrevet ovenfor. Videre er insektene lettere å inneholde, da de kan slås ned med CO2 på slutten av forsøket, og burene kan raskt lukkes igjen etter separasjon fra broen. Disse inneslutningsfordelene er ideelle for BSL 3-arbeid.
Vi erkjenner imidlertid at apparatet vårt bare tillater en binær beslutning i stedet for et fritt valg langs en gradient, som, avhengig av applikasjonen, kan kreve ekstra løp for å identifisere optimale temperaturer.
The authors have nothing to disclose.
AHR anerkjenner finansieringsstøtte fra Majlis Amanah Rakyat (MARA).
Acrylic tube (Bridge) | Perspex | 900 mm OD | Size (Length x diameter): 8 cm x 9 cm; 1 cm bigger than the size of the hole in front of the incubator. Size of the hole on top: 1.6 cm |
Carbon dioxide (CO2) inflator | Peaken | B08HM2BDDB | Any CO2 pen will work |
Digital Incubator (×2) | VWR | VWR INCU-Line 1L 10 (390-0384) | Size of hole in front of incubator: 8 cm diameter. Holes need to be position in the center and have the same exact position on both incubators to allow alignment of bridge.This should be pre-drilled using a standard 8 cm ‘holesaw’ drill bit. Incubator must be just large enough to contain one mosquito cage. |
Mechanical aspirator (for mosquitoes) | Watkins and Doncaster | E710 | Ideal barrel size 50 x 28 mm and tube diameter 9mm. |
Mosquito cage (×3; two for the experiments, one for storing insects) | BugDorm | BD4S1515 | Size: 17.5 cm x 17.5 cm x 17.5 cm with 12 cm sleeve opening. Mesh material : Knitted nylon |
Plastic funnel | Diameter of opening = 5 cm Length of funnel = 5 cm Diameter of aperture = 1 cm |
||
Plastic Pocket Pooter (for Drosophila or small insects) | Watkins and Doncaster | E714 | Manual/mouth aspirated |
Rubber band or Reusable cable tie | Either, depending on preference. | ||
Temperature probe | Eidyer | B07J4T1VQZ | Any thermometer with at least 100 cm narrow wire probe |