Otimização dos Parâmetros de Classificação por Citometria de Fluxo para Isolamento de Alto Rendimento e Purificação de Pequenas Vesículas Extracelulares

Summary

Este protocolo fornece um método de isolamento rápido e específico para pequenas vesículas extracelulares, otimizando o tamanho do bico de pulverização de ar, a pressão do fluido da bainha, a pressão do fluxo da amostra, a tensão, o ganho e os parâmetros do limiar de disparo.

Abstract

Pequenas vesículas extracelulares (sEV) podem ser liberadas de todos os tipos celulares e transportar proteínas, DNA e RNA. As moléculas sinalizadoras servem como indicadores do estado fisiológico e patológico de uma célula. No entanto, não há um método padrão para o isolamento de sEV, o que impede a identificação de biomarcadores a jusante e estudos de intervenção medicamentosa. Neste artigo, fornecemos um protocolo detalhado para o isolamento e purificação de sEV de 50-200 nm por um classificador de células de fluxo. Para isso, um bocal de 50 μm e uma pressão de fluido de bainha de 80 psi foram selecionados para obter uma boa taxa de classificação e fluxo lateral estável. Microesferas de poliestireno de tamanho padrão foram usadas para localizar populações de partículas de 100, 200 e 300 nm. Com a otimização adicional do limiar de disparo de tensão, ganho e dispersão direta (FSC), o sinal sEV pode ser separado do ruído de fundo. Essas otimizações fornecem um painel de configurações de classificação crítica que permite obter uma população representativa de sEV usando FSC vs. dispersão lateral (SSC) somente. O método de isolamento baseado em citometria de fluxo não só permite a análise de alto rendimento, mas também permite a classificação síncrona ou análise de proteoma de sEV com base na expressão de biomarcadores, abrindo inúmeras aplicações de pesquisa a jusante.

Introduction

Uma célula libera vesículas extracelulares (EVs) de tamanhos variados que resultam em moléculas sinalizadoras e inclusões de membrana, que são importantes para a comunicação intercelular¹. EVs de diferentes tamanhos também desempenham diferentes papéis biológicos, com 50-200 nm sEV sendo capaz de distribuir precisamente RNA, DNA e proteínas para o local extracelular correto. A EV também ajuda a determinar seus mecanismos de secreção, envolvendo não apenas a regulação de processos fisiológicos normais, como vigilância imunológica, manutenção de células-tronco, coagulação sanguínea e reparo tecidual, mas também a patologia subjacente a várias doenças, como progressão tumoral e metástase2,3. O isolamento e a análise eficazes de sEV são críticos para identificar biomarcadores e projetar futuras intervenções medicamentosas.

Com pesquisas contínuas sobre a aplicação clínica de sEV, os métodos de isolamento de sEV apresentaram requisitos mais elevados. Devido à heterogeneidade dos EVs em tamanho, fonte e conteúdo, bem como sua semelhança com outros EVs em propriedades físico-químicas e bioquímicas, não existe um método padrão para o isolamento de EVs ^4,5. Atualmente, ultracentrifugação, cromatografia de exclusão de tamanho (SEC), precipitação de polímero e captura de imunoafinidade são os métodos mais comuns de isolamento de sEV⁶. A ultracentrifugação ainda é o padrão ouro para o isolamento de sEV em pesquisas, apesar de ser demorada, resultando em baixa pureza com uma ampla distribuição de tamanho de 40-500 nm e danos mecânicos significativos ao sEV após centrifugação de longa duração ^7,8,9. A precipitação polimérica, que geralmente utiliza polietilenoglicol (PEG), sofre de pureza inaceitável para posterior análise funcional com precipitação concomitante de agregados proteicos extracelulares e contaminação do polímero^10,11. Métodos baseados em captura de imunoafinidade requerem anticorpos de alto custo com especificidade variável, além de apresentarem problemas com baixo volume de processamento e rendimento12,13,14. O tamanho das partículas é um dos principais indicadores para avaliar a pureza do sEV isolado. Embora a pureza do sEV continue sendo uma meta inatingível, o SEC remove uma quantidade considerável de componentes médios, e as partículas de sEV extraídas pelo método SEC estão principalmente na faixa de 50-200 nm¹⁵. As técnicas existentes apresentam algumas desvantagens, incluindo, mas não se limitando a, serem demoradas, de baixa pureza, baixo rendimento, baixa reprodutibilidade, baixo rendimento das amostras e dano potencial de sEV, o que a torna incompatível com o uso clínico¹⁶. Assim, um método de isolamento de sEV rápido, barato e com tamanho especificado aplicável a diversos biofluidos é uma necessidade essencial em várias situações clínicas e de pesquisa.

Na citometria de fluxo, partículas isoladas são analisadas de forma multiparamétrica de alto rendimento e os subconjuntos são separados¹⁷. Devido à heterogeneidade dos EVs, seria ideal uma medida por citometria de fluxo de partícula única, que tem sido utilizada para investigar EVs seguindo os paradigmas da análise celular, sendo utilizados marcadores de dispersão de luz e fluorescência para identificar características relacionadas à fisiologia e componentes proteicos^18,19,20. No entanto, a citometria de fluxo convencional é desafiada pelo pequeno tamanho do sEV e baixa abundância de biomarcadores de superfície. A sensibilidade da citometria de fluxo pode ser melhorada otimizando-se os parâmetros de detecção para distinguir ruído de fundo e sEV, independentemente do uso do parâmetro de dispersão direta (FSC), dispersão lateral (SSC) ou limiar de fluorescência¹⁹.

Com o presente protocolo, os ajustes de classificação por citometria de fluxo de alta resolução foram otimizados usando esferas fluorescentes como padrão. Ao selecionar o tamanho adequado do bico, a pressão do fluido da bainha, o parâmetro de disparo do limiar e as tensões que controlam as intensidades de luz espalhada, conseguimos isolar um subconjunto específico de sEV de uma mistura complexa.

Protocol

1. Cultura celular Preparar um meio de cultura de Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB). Cultura de célula humana de câncer de pâncreas, PANC-1, em frasco de 75cm2 a uma densidade de 1 x 106 células/mL. Incubar a cultura a 37 °C com 5% de CO2. Subcultivar as células quando a densidade celular atingir 75%-80% sob observação microscópica. Retire o meio e lave 2x com 3-5 mL de solução salina tam…

Representative Results

O fluxograma do protocolo experimental é mostrado na Figura 1. Neste método, microesferas de poliestireno de tamanho padrão foram usadas como padrões de referência para distribuição de tamanho de partículas. Sob a condição de parâmetro instrumental específico, o sinal de partícula pode ser claramente distinguido do ruído de fundo no gráfico FSC vs. SSC usando a forma logarítmica. As estratégias de gating são mostradas na Figura 2. R4, R5 e R6 r…

Discussion

Este protocolo descreve um método otimizado para isolar e purificar sEV com o tamanho de partícula especificado de 50-200 nm usando um classificador de células de fluxo, que foi validado por NTA. O método resolveu o problema do gargalo de obtenção de sEV com granulometria uniforme e alta pureza, evitando a interferência de moléculas biológicas não relacionadas envoltas em EVs de grande porte²². Análises rápidas e de alto rendimento são possíveis com a citometria de fluxo, que pode ca…

Materials

Centrifuge tube	Beckman Coulter	344058
Culture flasks	Corning	430641
Dulbecco’s modified eagle medium	Corning Cellgro	10-013-CV
Fetal bovine serum	SUER	SUER050QY
Flow cell sorter	Beckman Coulter	Moflo Astrios EQ
Human pancreatic cancer cell, PANC-1	NA	NA	PANC-1 cells were donated by Professor Weijun Yang, College of Life Sciences, Zhejiang University
Laser particle size and zeta potential analyzer	Malvern	Zetasizer Nano ZS 90
Phosphate buffer saline	Gibco	C20012500BT
Polystyrene fluorescent microspheres	Beckman Coulter	6602336
Transmission electron microscopy	JEOL	JEM-1200EX
Trypsin-EDTA solution	Gibco	1713949
Ultra rainbow fluorescent particles	Beckman Coulter	B28479
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima-L80XP
Ultracentrifuge rotor	Beckman Coulter	SW32TI