Optimización de los parámetros de clasificación por citometría de flujo para el aislamiento y purificación de alto rendimiento de pequeñas vesículas extracelulares

Summary

Este protocolo proporciona un método de aislamiento rápido y específico del tamaño para pequeñas vesículas extracelulares al optimizar el tamaño de la boquilla de pulverización de aire, la presión del fluido de la vaina, la presión del flujo de muestra, el voltaje, la ganancia y los parámetros del umbral de activación.

Abstract

Las pequeñas vesículas extracelulares (sEV) pueden liberarse de todos los tipos de células y transportar proteínas, ADN y ARN. Las moléculas de señalización sirven como indicadores del estado fisiológico y patológico de una célula. Sin embargo, no existe un método estándar para el aislamiento de sEV, que impide la identificación de biomarcadores posteriores y los estudios de intervención farmacológica. En este artículo, proporcionamos un protocolo detallado para el aislamiento y purificación de 50-200 nm sEV mediante un clasificador de células de flujo. Para esto, se seleccionó una boquilla de 50 μm y una presión de fluido de vaina de 80 psi para obtener una buena velocidad de clasificación y una corriente lateral estable. Se utilizaron microesferas de poliestireno de tamaño estándar para localizar poblaciones de partículas de 100, 200 y 300 nm. Con una optimización adicional del umbral de activación de voltaje, ganancia y dispersión directa (FSC), la señal sEV podría separarse del ruido de fondo. Estas optimizaciones proporcionan un panel de configuraciones de ordenación críticas que permite obtener una población representativa de sEV utilizando FSC frente a dispersión lateral (SSC) solamente. El método de aislamiento basado en citometría de flujo no solo permite el análisis de alto rendimiento, sino que también permite la clasificación sincrónica o el análisis del proteoma de sEV basado en la expresión del biomarcador, abriendo numerosas aplicaciones de investigación posteriores.

Introduction

Una célula libera vesículas extracelulares (EV) de diferentes tamaños que resultan en moléculas de señalización e inclusiones de membrana, que son importantes para la comunicación intercelular¹. Los EV de diferentes tamaños también desempeñan diferentes funciones biológicas, con 50-200 nm sEV que pueden distribuir con precisión ARN, ADN y proteínas a la ubicación extracelular correcta. El sEV también ayuda a determinar sus mecanismos de secreción, involucrando no sólo la regulación de los procesos fisiológicos normales, como la vigilancia inmune, el mantenimiento de células madre, la coagulación sanguínea y la reparación de tejidos, sino también la patología subyacente a varias enfermedades, como la progresión tumoral y la metástasis ^2,3. El aislamiento y el análisis efectivos de sEV son críticos para identificar biomarcadores y diseñar futuras intervenciones farmacológicas.

Con la investigación continua sobre la aplicación clínica de sEV, los métodos de aislamiento de sEV han presentado requisitos más altos. Debido a la heterogeneidad del sEV en tamaño, fuente y contenido, así como a su similitud con otros EV en propiedades fisicoquímicas y bioquímicas, no existe un método estándar para el aislamiento de sEV ^4,5. Actualmente, la ultracentrifugación, la cromatografía de exclusión de tamaño (SEC), la precipitación de polímeros y la captura de inmunoafinidad son los métodos de aislamiento de sEV más comunes⁶. La ultracentrifugación sigue siendo el estándar de oro para el aislamiento de sEV en la investigación, a pesar de llevar mucho tiempo, lo que resulta en una baja pureza con una amplia distribución de tamaño de 40-500 nm y daños mecánicos significativos en el sEV después de la centrifugación a largo plazo ^7,8,9. La precipitación polimérica, que generalmente utiliza polietilenglicol (PEG), adolece de una pureza inaceptable para el análisis funcional posterior con precipitación concomitante de agregados proteicos extracelulares y contaminación polimérica^10,11. Los métodos basados en la captura de inmunoafinidad requieren anticuerpos de alto costo con especificidad variable, así como problemas con el bajo volumen de procesamiento y rendimientos 12,13,14. El tamaño de partícula es uno de los principales indicadores para evaluar la pureza del sEV aislado. Aunque la pureza de sEV sigue siendo un objetivo inalcanzable, SEC elimina una cantidad considerable de componentes medios, y las partículas de sEV extraídas por el método SEC están principalmente en el rango de 50-200 nm¹⁵. Las técnicas existentes tienen algunas desventajas, incluyendo pero no limitado a ser lentas, baja pureza, bajo rendimiento, poca reproducibilidad, bajo rendimiento de las muestras, y daño potencial de sEV, lo que lo hace incompatible con la utilización clínica¹⁶. Por lo tanto, un método de aislamiento de sEV rápido, económico y de tamaño especificado aplicable a diversos biofluidos es una necesidad esencial en varias situaciones clínicas y de investigación.

En la citometría de flujo, las partículas individuales se analizan de manera multiparamétrica de alto rendimiento y los subconjuntos se clasifican¹⁷. Debido a la heterogeneidad de las EV, sería ideal una medición citométrica de flujo de una sola partícula, que se ha utilizado para investigar las EV siguiendo los paradigmas del análisis celular, con etiquetas de dispersión de luz y fluorescencia utilizadas para identificar características relacionadas con la fisiología y componentes proteicos^18,19,20. Sin embargo, la citometría de flujo convencional se ve desafiada por el pequeño tamaño de sEV y la baja abundancia de biomarcadores de superficie. La sensibilidad de la citometría de flujo podría mejorarse optimizando los parámetros de detección para distinguir el ruido de fondo y el sEV, independientemente del uso del parámetro¹⁹ de dispersión directa (FSC), dispersión lateral (SSC) o umbral de fluorescencia.

Con el protocolo actual, los ajustes de clasificación por citometría de flujo de alta resolución se optimizaron utilizando perlas fluorescentes como estándar. Al seleccionar el tamaño adecuado de la boquilla, la presión del fluido de la vaina, el parámetro de activación del umbral y los voltajes que controlan las intensidades de luz dispersa, pudimos aislar un subconjunto específico de sEV de una mezcla compleja.

Protocol

1. Cultivo celular Prepare un medio de cultivo del Medio Águila Modificada (DMEM) de Dulbecco suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS). Cultivar la célula de cáncer de páncreas humano, PANC-1, en un matraz de cultivo de 75cm2 a una densidad de 1 x 106 células/ml. Incubar el cultivo a 37 °C con un 5% deCO2. Subcultivo de las células cuando la densidad celular alcanza el 75%-80% bajo observación microscópica. Retire el medio y enjuague 2…

Representative Results

El diagrama de flujo para el protocolo experimental se muestra en la Figura 1. En este método, se utilizaron microesferas de poliestireno de tamaño estándar como estándares de referencia para la distribución del tamaño de partícula. Bajo la condición específica del parámetro instrumental, la señal de partícula podría distinguirse claramente del ruido de fondo en la gráfica FSC vs. SSC utilizando la forma logarítmica. Las estrategias de acceso se muestran en <strong class="xfig…

Discussion

Este protocolo describe un método optimizado para aislar y purificar sEV con el tamaño de partícula especificado de 50-200 nm utilizando un clasificador de células de flujo, que fue validado por NTA. El método resolvió el problema del cuello de botella de obtener sEV con tamaño de partícula uniforme y alta pureza, evitando la interferencia de moléculas biológicas no relacionadas envueltas en EV de gran tamaño²². Los análisis rápidos y de alto rendimiento son posibles con la citometrí…

Materials

Centrifuge tube	Beckman Coulter	344058
Culture flasks	Corning	430641
Dulbecco’s modified eagle medium	Corning Cellgro	10-013-CV
Fetal bovine serum	SUER	SUER050QY
Flow cell sorter	Beckman Coulter	Moflo Astrios EQ
Human pancreatic cancer cell, PANC-1	NA	NA	PANC-1 cells were donated by Professor Weijun Yang, College of Life Sciences, Zhejiang University
Laser particle size and zeta potential analyzer	Malvern	Zetasizer Nano ZS 90
Phosphate buffer saline	Gibco	C20012500BT
Polystyrene fluorescent microspheres	Beckman Coulter	6602336
Transmission electron microscopy	JEOL	JEM-1200EX
Trypsin-EDTA solution	Gibco	1713949
Ultra rainbow fluorescent particles	Beckman Coulter	B28479
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima-L80XP
Ultracentrifuge rotor	Beckman Coulter	SW32TI