Tredimensjonalt hjertevev bioengineered ved hjelp av stamcelleavledede kardiomyocytter har dukket opp som lovende modeller for å studere sunt og sykt humant myokard in vitro , samtidig som de rekapitulerer viktige aspekter ved den opprinnelige hjertenisjen. Dette manuskriptet beskriver en protokoll for fremstilling og analyse av høyt innhold konstruert hjertevev generert fra humane induserte pluripotente stamcelleavledede kardiomyocytter.
Hjertesvikt er fortsatt den ledende dødsårsaken over hele verden, noe som skaper et presserende behov for bedre prekliniske modeller av det menneskelige hjerte. Vevsteknikk er avgjørende for grunnvitenskapelig hjerteforskning; in vitro human cellekultur eliminerer forskjellene mellom artene i dyremodeller, mens et mer vevslignende 3D-miljø (f.eks. med ekstracellulær matrise og heterocellulær kobling) simulerer in vivo-forhold i større grad enn tradisjonell todimensjonal kultur på petriskåler av plast. Imidlertid krever hvert modellsystem spesialisert utstyr, for eksempel spesialdesignede bioreaktorer og funksjonelle vurderingsenheter. I tillegg er disse protokollene ofte kompliserte, arbeidskrevende og plaget av svikt i de små, delikate vevene.
Denne artikkelen beskriver en prosess for å generere et robust humant konstruert hjertevev (hECT) modellsystem ved bruk av induserte pluripotente stamcelleavledede kardiomyocytter for langsgående måling av vevsfunksjon. Seks hekter med lineær stripegeometri dyrkes parallelt, med hver hECT suspendert fra et par kraftfølende polydimetylsiloksan (PDMS) innlegg festet til PDMS-stativer. Hvert innlegg er avkortet med en svart PDMS stabil postsporing (SPoT), en ny funksjon som forbedrer brukervennligheten, gjennomstrømningen, vevsretensjonen og datakvaliteten. Formen muliggjør pålitelig optisk sporing av postavbøyninger, noe som gir forbedrede rykningskraftsporinger med absolutt aktiv og passiv spenning. Hettegeometrien eliminerer vevssvikt på grunn av at hekter glir av stolpene, og da de involverer et andre trinn etter PDMS-rackfabrikasjon, kan SPoTs legges til eksisterende PDMS-postbaserte design uten store endringer i bioreaktorfabrikasjonsprosessen.
Systemet brukes til å demonstrere viktigheten av å måle hECT-funksjonen ved fysiologiske temperaturer og viser stabil vevsfunksjon under datainnsamling. Oppsummert beskriver vi et toppmoderne modellsystem som reproduserer viktige fysiologiske forhold for å fremme biofidelitet, effektivitet og strenghet av konstruerte hjertevev for in vitro-applikasjoner .
Konstruerte hjertevevsmodeller kommer i et mangfoldig utvalg av geometrier og konfigurasjoner for å rekapitulere ulike aspekter av den opprinnelige hjertenisjen som er vanskelig å oppnå med tradisjonell todimensjonal cellekultur. En av de vanligste konfigurasjonene er den lineære vevsstrimmelen, med fleksible ankre i hver ende for å indusere vevets selvmontering og gi vevet en definert forspenning og en avlesning av de resulterende rykningskreftene 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20,21
,22,23,24,25,26,27. Kraften som genereres kan bestemmes robust gjennom optisk sporing av vevsforkortelsen og ved hjelp av elastisk stråleteori for å beregne kraften fra de målte avbøyningene og fjærkonstanten til ankrene 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20,
21,22,25,26,28.
Imidlertid er hjertevevsteknikk fortsatt et utviklende felt, og noen utfordringer gjenstår. Spesialutstyr, for eksempel skreddersydde bioreaktorer og funksjonelle vurderingsenheter, kreves for hvert modellsystem 10,29,30,31. Størrelsen og kompleksiteten til mikromiljøet til disse konstruksjonene er ofte begrenset av lav gjennomstrømning på grunn av arbeidsintensive protokoller, høyt antall celler og vevssårbarhet. For å løse dette har noen grupper vendt seg til fabrikasjon av mikrovev som bare inneholder hundrevis eller tusenvis av celler for å lette analyser med høy gjennomstrømning som er nyttige for narkotikaforskning. Denne reduserte skalaen kompliserer imidlertid den nøyaktige vurderingen av funksjon12, eliminerer viktige aspekter ved den opprinnelige hjertenisjen (som næringsstoffer / oksygendiffusjonsgradienter og kompleks arkitektur36), og begrenser mengden materiale som er tilgjengelig for påfølgende molekylær og strukturell analyse (som ofte krever sammenslåing av vevene). Tabell 1 oppsummerer noen av konfigurasjonene av lineære vevsstrimmelmodeller i litteraturen 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15, 16,17,18,19,20,
21,22,23,24,25,26,37,38,39,40.
Gruppe | Celler per vev | Vev per plate | Plate format | Forankringsfunksjon | Metode for funksjonell datainnsamling | Delt mediebad? | Funksjonelt mål- ment in situ? |
||||
Yoshida (ECT) 38 | 4 millioner | 6 | modifisert 6-brønns plate* | Kraft-svinger | Direkte kraftmåling | Nei | Nei | ||||
Chan (hESC-CM-ECTs)26 | 310 k | 6 | Tilpasset 6-brønns tallerken | PDMS innlegg | Direkte kraftmåling | Ja | Nei | ||||
Feinberg (dyn-EHT)16 | 1,5 millioner | 6 | Tilpasset 6-brønns tallerken | PDMS ledning | vev form | Nei | Ja | ||||
RADISIC (BioWire)39, 40 | 110 k | 8 | polymer wire | Tråd form | Ja | Ja | |||||
Costa (enkelt hekt)1, 2 | 1-2 millioner | 4** | 10 cm petriskål** | PDMS innlegg | optisk avbøyning (kant-/objektsporing) | Ja | Ja | ||||
Costa (flere hekt) 3–9 | 500 K-1 millioner | 6 | 6 cm petriskål | PDMS innlegg | optisk avbøyning (kant-/objektsporing) | Ja | Ja | ||||
Costa (multi-hECT m / SPoT) | 1 millioner | 6 | 6 cm petriskål | PDMS-innlegg med svarte caps | optisk avbøyning (objektsporing) | Ja | Ja | ||||
Passier (EHT)17 | 245 k | 36 | 12-brønns plate | PDMS-innlegg med svarte caps | optisk avbøyning (objektsporing) | Ja | Ja | ||||
Vunjak-Novakovic13, 18 | 1 millioner | 12 | 6 cm petriskål | PDMS-innlegg med caps | optisk avbøyning (kantdeteksjon) | Ja | Ja | ||||
Vunjak-Novakovic (MilliPillar)14 | 550 k | 6 | Tilpasset 6-brønns tallerken | PDMS-innlegg med caps | optisk avbøyning (objektsporing); kalsium avbildning | Nei | Ja | ||||
Eschenhagen (EHT)10, 19–21 | 1 millioner | 12 | 12-brønns plate | PDMS-innlegg med caps | optisk avbøyning (kantdeteksjon av post avbøyning); kalsium avbildning | Nei | Ja | ||||
Zandstra (CaMiRi)22 | 25-150 k | 96 | 96-brønns plate | PDMS-innlegg med kroker | optisk avbøyning (kantdeteksjon) | Nei | Ja | ||||
Murry23, 24 | 900 k | 24 | 24-brønns plate | PDMS-stolper med caps, integrert magnet | magnetisk sensor | Nei | Ja | ||||
Riket (μTUG)11, 12, 25 | Udefinert | 156 | 156-brønns tallerken | PDMS-stolper med caps, integrert magnet | optisk sporing (fluorescerende perle) | Ja | Ja |
Tabell 1: Karakteristika for noen lineærkonstruerte hjertevevsmodeller i litteraturen. Lineærkonstruerte hjertevevsmodeller varierer i størrelse, gjennomstrømning, forankringsfunksjonsdesign og tilrettelegging av delte mellomstore bad, samt kravene til et eget muskelbadsystem for funksjonell karakterisering. * Forskerne brukte et kommersielt tilgjengelig konstruert vevssystem basert på dimensjonene til en standard 6-brønnsplate. ** Et modulært system der enkeltvevsbioreaktorer er forankret til en hvilken som helst plastkulturskål i ønsket antall og plassering.
Dette papiret beskriver den nyeste protokollen for å fremstille vår etablerte modell av lineært humant konstruert hjertevev (hECT) 1,2,3,4,5,6,7,8,9,15,27 og metoder for vurdering av hECT-kontraktil funksjon. Hver bioreaktor med flere vev har plass til opptil seks hektar i et delt mediumbad og består av to “rack” -stykker laget av silikonelastomerpolydimetylsiloksan (PDMS) montert på en stiv polysulfonramme. Hvert PDMS-stativ inneholder seks fleksible integrerte kraftsensorstolper som er 0,5 mm i diameter og 3,25 mm lange, og sammen gir to stativer seks par stolper, som hver har en hECT. Inversjon av bioreaktoren bidrar til å overvinne enhver hindring for visualisering av hektene nedenfra på grunn av vannkondens fra kulturmediet eller forvrengninger fra menisken i luft-væske-grensesnittet. Hver sammentrekning av en hECT forårsaker avbøyning av de integrerte endestolpene, og den optiske målingen av avbøyningssignalet behandles til en kraft-mot-tidssporing som representerer den kontraktile funksjonen til hECT 1,2,3,4,5,6,7,8,9,15,27 . Sammenlignet med enkeltvevsbioreaktorene som vanligvis brukes til vev av denne størrelsen, forbedrer multivevsdesignet den eksperimentelle gjennomstrømningen og muliggjør studier av parakrin signalering mellom tilstøtende vev med potensielt forskjellig cellulær sammensetning. Dette systemet har blitt validert i publiserte studier som beskriver anvendelser i sykdomsmodellering 4,8, parakrin signalering 6,7, heterocellulær kultur 5,9 og terapeutisk screening 7,9.
I dette systemet er hECT-ene designet for å være omtrent 6 mm lange og 0,5 mm i diameter for å muliggjøre robust optisk sporing av kraftmålinger med lite støy. Videre er aspekter av vevskompleksitet som diffusjonsgradienter og cellulær organisasjon balansert med et håndterbart krav på 1 million celler per vev. Med standard CCD-kamerateknologi genererer krefter så svake som 1 μN (som representerer mindre enn 5 μm etter nedbøyning) et klart signal, noe som sikrer at selv ekstremt svak kontraktil funksjon, som observert med noen hECT-sykdomsmodeller, kan måles nøyaktig. Dette forenkler også den detaljerte analysen av rykningskraftkurven, og muliggjør dermed analyse av høyt innhold av opptil 16 kontraktilitetsmålinger41, inkludert utviklet kraft, sammentrekningshastigheter (+dF/dt) og avslapning (-dF/dt) og variasjon i slaghastighet.
Denne protokollen begynner med instruksjoner for fremstilling av bioreaktorkomponentene. Spesiell oppmerksomhet rettes mot trinnene for å maksimere hECT-utbyttet, redusere teknisk variasjon i vevsfunksjonen og optimalisere kvaliteten og dybden av vevsvurderingen. De fleste hjertevevstekniske studier rapporterer ikke frekvenser av vevstap under fabrikasjon og langsiktig testing, selv om det er en kjent utfordring i feltet og reduserer gjennomstrømningen og effektiviteten til studiene27. De vevstekniske metodene beskrevet her har blitt raffinert gjennom årene for å sikre oppbevaring av alle hECTs i de fleste bioreaktorer (uavhengig av hvordan PDMS-stativene er produsert). Selv 5% -20% tap av vev kan imidlertid påvirke den statistiske styrken betydelig, spesielt i mindre eksperimenter begrenset av antall tilgjengelige kardiomyocytter (f.eks. på grunn av differensieringsutfordringer med noen syke cellelinjer4 eller på grunn av høye kostnader for kommersielt kjøpte kardiomyocytter), eller ved behandlingstilstanden (f.eks. begrenset tilgjengelighet eller høye kostnader for forskjellige behandlingsforbindelser).
Denne protokollen beskriver fabrikasjon av stabile postsporere (SPoTs), en ny funksjon i PDMS-rackene, som fungerer som caps i enden av kraftfølerstolpene som holder hECTs27. Det er demonstrert hvordan hettegeometrien signifikant reduserer hECT-tapet fra å falle eller trekke av stolpene, og dermed åpne nye muligheter for dyrking av hECTs med større variasjon av stivheter og spenninger, som er utfordrende for kultur på uavkortede innlegg. I tillegg gir SPoTs et objekt med høy kontrast for å forbedre den optiske sporingen av hECT-sammentrekningen gjennom en konsekvent og veldefinert form27. Dette etterfølges av en beskrivelse av dyrking av humaninduserte pluripotente stamceller (iPSCs) og kardiomyocyttdifferensiering basert på tidligere publiserte protokoller 3,42,43 og en forklaring av hECT-fabrikasjon, kultur og funksjonelle målinger.
Denne artikkelen tar også for seg behovet for å måle vevsfunksjonen ved fysiologisk temperatur. Humant myokard (føtalt så vel som voksent sunt og sykt vev), samt hjertevev fra et bredt spekter av dyrearter (inkludert rotter, katter, mus, ildere og kaniner)44,45, viser en markert økning i frekvensmatchet rykningskraft ved temperaturer på 28 ° C-32 ° C sammenlignet med fysiologisk temperatur – et fenomen kjent som hypoterm inotropi45, 46. Imidlertid forblir effekten av temperatur på konstruert myokardvevsfunksjon understudert. Mange nyere konstruerte hjertevevsmodeller i litteraturen er designet for å bli funksjonelt vurdert ved 37 °C for å tilnærme fysiologiske forhold 13,14,37. Men så vidt vi vet, har de temperaturavhengige effektene på kraften generert av konstruerte hjertevev ikke blitt systematisk undersøkt. Denne protokollen beskriver en pacingelektrodedesign som minimerer varmetap under testing, samt tillater inkorporering av et isolert varmeelement i oppsettet for funksjonelle målinger, som kan opprettholde hektene ved fysiologisk temperatur uten at det går ut over steriliteten27. Vi rapporterer deretter noen av de observerte effektene av temperatur på hECT-funksjonen, inkludert på den utviklede kraften, spontan slagfrekvens, +dF / dt og -dF / dt. Til sammen gir dette papiret detaljene som kreves for å produsere dette multi-tissue force-sensing bioreaktorsystemet for å fremstille humant konstruert hjertevev og å vurdere deres kontraktile funksjon, og et sett med data presenteres som gir et sammenligningsgrunnlag for målinger ved romtemperatur og ved 37 ° C27.
Det finnes mange lineærkonstruerte hjertevevsmodeller publisert i litteraturen, hvorav noen er beskrevet i tabell 1. Noen modeller involverer direkte måling av vevskraften, men disse krever vanligvis overføring av konstruksjonen til et eget muskelbad38. De fleste modeller er designet med vevene permanent forankret i begge ender, oftest til PDMS-innlegg 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16 …
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne anerkjenner Dr. Timothy Cashman for tidligere arbeid med denne metoden. Denne studien ble støttet av finansiering fra National Institutes of Health (NIH) (R01-HL132226 og K01 HL133424) og Leducq Foundation International Networks of Excellence Program (CURE-PLaN).
0.25 mm diamete 304 Stainless Steel Wire | McMaster Carr | 6517K61 | |
0.25% trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | |
1.7 mL Microtubes | Axygen | MCT-175-C | |
10 cm dishes (20 mm tall) | Corning | 353003 | |
10 mL Serological Pipette | Drummond | 6-000-010 | |
10 N NaOH | Fisher Scientific | SS225-1 | dilute 1:10 in sterile distilled water |
10X Modified Eagle Medium | Sigma Aldrich | M0275 | |
20 – 200 μL Micropipette | Eppendorf | 3123000055 | |
200 μL MicroPipette Tips | VWR | 76322-150 | |
5 mL Serological Pipette | Drummond | 6-000-005 | |
50 mL Conical Centrifuge Tubes | Falcon | 352070 | |
6 cm Petri Dish | Corning | 353002 | |
6 Watt LED Dual Gooseneck Illuminator | AmScope | LED-6W | |
6-Well Plates | Corning | 353046 | |
90 degree angle mirror | Edmund Optics | 45-594 | |
Acrylic bonding glue | SCIGRIP | #4 | |
Adjustable 10 cm x 10 cm jack | Fisher Scientific | 14-673-50 | |
Aluminum 6061 | McMaster Carr | 9008K82 | |
A-Plan 10X Objective Lens | ZEISS | 1020-863 | |
Autoclave Bags | Propper | 21002 | |
B-27 supplement | ThermoFisher | 17504044 | |
B-27 supplement (without insulin) | ThermoFisher | A1895601 | |
Benchtop Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
Black ABS | Ultimaker | 2.85 mm wide | |
Bovine Collagen I | Gibco | A1064401 | |
CHIR99021 | Tocris | 4423 | |
Class II Biosafety Cabinet | Labconco | 3430009 | |
Clear Acrylic Sheeting | estreetplastics | 1002502436 | 6.25 mm thick |
CNC Vertical Mill | Haas | VF-1 | |
Conductive Graphite Bars | McMaster Carr | 1763T33 | |
Dissection microscope | Olympus | SZ61 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 Nutrient Mix | ThermoFisher | 11330032 | |
Ethanol | Fisher Scientific | A4094 | Dilute to 70% in water |
EVE Automated Cell counter | NanoEntek | E1000 | |
EVE Cell Counting Slide | NanoEntek | EVS-050 | |
Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10438026 | |
Fine Curved Forceps | Fine Science Tools | 11253-25 | |
Forma Series II Water Jacketed CO2 Incubator | Thermo Electron Corporation | 3110 | AKA "incubator". With HEPA class 100 filter |
Fusion360 software | Autodesk | AKA "CAD software" | |
Glass Hemocytometer | Reichert | 1475 | 0.1 mm deep |
HEPES | Sigma Aldrich | H3784 | |
hESC qualified matrigel | Corning | 354277 | AKA "basement membrane matrix". Store in frozen aliquots |
High Speed CCD Camera | PixelLINK | P7410 | |
Inverted Microscope | Carl Zeiss Werk | Axiovert 40 CFL | 10X phase contrast objective |
IWR-1 | Selleck Chem | S7086 | |
LabView Software | National Instruments | 2016 | |
Laminar flow clean bench | NuAire | NU-201-330 | necessary for hECT functional analysis |
Laptop | AsusTek | Strix | Intel Core i& processor ,CPU 2.8GHz, 16GB RAM |
Laser Cutting Machine | Epilog | Helix 24 | |
Magnification headset | ExcelBlades | 70020 | Recommended for steps requiring fine manipulations |
Matlab | Mathworks | Version 2019b or later | AKA "data analysis software" |
Micro Vannas Scissors, 3 mm blade | WPI Instruments | 501839 | |
Microscope Boom Stand | Olympus | SZ2-STU1 | |
Penicillin-Streptomycin stock solution | ThermoFisher | 15140122 | 10,000 IU/ml penicillin; 10,000 μg/ml streptomycin |
Phosphate-buffered saline without divalent cations | Sigma Aldrich | P3813 | Diluted in distilled water to 1X and 10X concentrations |
Pipette Controller | Drummond | 4-000-100 | |
PixelLINK Capture OEM | PixelLINK | 10.2.1.6 | AKA "Camera Software" |
Polysulfone | McMaster Carr | 86735K73 | translucent amber color |
Polytetrafluoroethylene (PTFE) | McMaster Carr | 8545K176 | Black, molded |
ReLeSR | Stem Cell Technologies | 5872 | AKA "iPSC dissociation media" |
Rosewell Park Memorial Institute 1640 Media | ThermoFisher | 11875135 | |
Silicone Sheeting | SMI manufacturing | glossy, 0.02 in thickness, durometer 40 | |
Size 10/0 Blue, Green, Red, and Yellow Glass Seed Beads | Michael's | color should withstand autoclaving | |
Spatula | Fisher Scientific | 14-373 | used for mixing PDMS |
Square Pulse Stimulator | Astro-Med / Grass Technologies | S88X | |
Stainless Steel Razoblades | GEM | 62-0179-CTN | preferred over non-stainless steel due to lower hardness |
Stemflex | ThermoFisher | A3349401 | AKA "iPSC culture media" |
Sterile distilled water | ThermoFisher | 5230 | |
Sylgard 170 - Silicone Elastomer Encapsulant Black 0.9 kg Kit | Dow | DOWSIL 170 2LB KIT | AKA black Polydimethylsiloxane (black PDMS) |
Sylgard 184 – Silicone Elastomer Clear 1 lb Kit | Dow | DC 184 SYLGARD 0.5KG 1.1LB KIT | AKA Polydimethylsiloxane (PDMS) |
Temperature-controlled heated stage | Okolab | H401-HG-SMU | Set height to 10 cm |
Thermoplastic 3D printer | Ultimaker | Ultimaker 3 | |
Thiazovivin | Selleck Chem | S1459 | |
Trypan Blue | NanoEntek | EBT-001 | |
Vacuum Chamber | Bel-Art Parts | F42027-0000 | |
Variable Speed Mini Band Saw | Micro-Mark | 82203 | |
Variable Speed Miniature Drill Press | Micro-Mark | 82959 | |
Vibration Isolation Table | Labconco | 3618000 | |
Weighing Boats | VWR | 10803-140 | |
Talon Cylinder Bench Clamp | VWR | 97035-528 | AKA screw clamp |