Design af en bioreaktor til forbedring af dataindsamling og modellering af gennemstrømning af manipuleret hjertevæv

Summary

Tredimensionelle hjertevæv biomanipuleret ved hjælp af stamcelleafledte kardiomyocytter har vist sig som lovende modeller til at studere sundt og sygt humant myokardium in vitro , mens de rekapitulerer nøgleaspekter af den indfødte hjerteniche. Dette manuskript beskriver en protokol til fremstilling og analyse af højindhold konstrueret hjertevæv genereret fra humant inducerede pluripotente stamcelleafledte kardiomyocytter.

Abstract

Hjertesvigt er fortsat den største dødsårsag på verdensplan, hvilket skaber et presserende behov for bedre prækliniske modeller af det menneskelige hjerte. Vævsteknik er afgørende for grundvidenskabelig hjerteforskning; in vitro human cellekultur eliminerer forskellene mellem dyremodeller, mens et mere vævslignende 3D-miljø (f.eks. med ekstracellulær matrix og heterocellulær kobling) simulerer in vivo-forhold i højere grad end traditionel todimensionel kultur på petriskåle af plast. Hvert modelsystem kræver dog specialudstyr, for eksempel specialdesignede bioreaktorer og funktionelle vurderingsenheder. Derudover er disse protokoller ofte komplicerede, arbejdskrævende og plaget af svigt i det små, sarte væv.

Dette papir beskriver en proces til generering af et robust humant konstrueret hjertevæv (hECT) modelsystem ved hjælp af inducerede pluripotente stamcelleafledte kardiomyocytter til langsgående måling af vævsfunktion. Seks hECT’er med lineær strimmelgeometri dyrkes parallelt, hvor hver hECT suspenderes fra et par kraftfølende polydimethylsiloxan (PDMS) stolper fastgjort til PDMS-stativer. Hvert indlæg er dækket med en sort PDMS stabil post tracker (SPoT), en ny funktion, der forbedrer brugervenligheden, gennemstrømningen, vævsretention og datakvalitet. Formen giver mulighed for pålidelig optisk sporing af stolpeafbøjninger, hvilket giver forbedrede trækkraftsporinger med absolut aktiv og passiv spænding. Hættegeometrien eliminerer vævssvigt på grund af hECT’er, der glider af stolperne, og da de involverer et andet trin efter PDMS-rackfremstilling, kan SPoT’erne føjes til eksisterende PDMS postbaserede designs uden større ændringer i bioreaktorfremstillingsprocessen.

Systemet bruges til at demonstrere vigtigheden af at måle hECT-funktionen ved fysiologiske temperaturer og viser stabil vævsfunktion under dataindsamling. Sammenfattende beskriver vi et avanceret modelsystem, der gengiver vigtige fysiologiske forhold for at fremme biofidelitet, effektivitet og stringens af konstruerede hjertevæv til in vitro-applikationer .

Introduction

Konstruerede hjertevævsmodeller findes i en bred vifte af geometrier og konfigurationer til rekapitulering af forskellige aspekter af den oprindelige hjerteniche, der er vanskelige at opnå med traditionel todimensionel cellekultur. En af de mest almindelige konfigurationer er den lineære vævsstrimmel med fleksible ankre i hver ende for at inducere vævets selvsamling og give vævet en defineret forbelastning og en aflæsning af de resulterende trækkræfter ^{1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,} 12,13,14,15,16,17,18,19,20,21
^,22,23,24,25,26,27. Den genererede kraft kan bestemmes robust ved optisk sporing af vævsforkortelsen og ved hjælp af elastisk stråleteori til beregning af kraften fra de målte afbøjninger og fjederkonstanten for ankrene 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11^, 12,13,14,15,16,17,18,19,20^,
21,22,25,26,28.

Imidlertid er hjertevævsteknik stadig et udviklingsfelt, og der er stadig nogle udfordringer. Specialudstyr, såsom specialfremstillede bioreaktorer og funktionelle vurderingsenheder, kræves til hvert modelsystem 10,29,30,31. Størrelsen og kompleksiteten af mikromiljøet i disse konstruktioner er ofte begrænset af lav gennemstrømning på grund af arbejdskrævende protokoller, et stort antal celler og vævssvaghed. For at løse dette har nogle grupper henvendt sig til fremstilling af mikrovæv, der kun indeholder hundreder eller tusinder af celler for at lette analyser med høj kapacitet, der er nyttige til lægemiddelopdagelse. Denne reducerede skala komplicerer imidlertid den nøjagtige vurdering af funktion¹², eliminerer nøgleaspekter af den oprindelige hjerteniche (såsom næringsstof/iltdiffusionsgradienter og kompleks arkitektur³⁶) og begrænser mængden af materiale, der er tilgængeligt til efterfølgende molekylær og strukturel analyse (ofte kræver pooling af vævene). Tabel 1 opsummerer nogle af konfigurationerne af lineære vævsstrimmelmodeller i litteraturen 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15^, 16,17,18,19,20^,
21,22,23,24,25,26,37,38,39,40.

Gruppe		Celler pr. væv	Væv pr. plade	Plade format		Forankring funktion		Funktionel dataindsamlingsmetode		Fælles mediebad?	Funktionel foranstaltning- ment in situ?
Yoshida (ECT)38		4 millioner dollars	6	Modificeret 6-brønds plade*		Kraft transducer		Måling af direkte kraft		Nej	Nej
Chan (hESC-CM-ECT)26		310 K	6	brugerdefineret 6-brønds skål		PDMS indlæg		Måling af direkte kraft		Ja	Nej
Feinberg (dyn-EHT)16		1,5 millioner dollars	6	brugerdefineret 6-brønds skål		PDMS-ledning		vævets form		Nej	Ja
RADISIC (BioWire)39, 40		110 K	8			polymer tråd		Trådform		Ja	Ja
Costa (enkelt hECT)1, 2		1-2 millioner dollars	4**	10 cm petriskål**		PDMS indlæg		Optisk afbøjning (kant-/objektsporing)		Ja	Ja
Costa (multi-hECT)3–9		500 K-1 million	6	6 cm petriskål		PDMS indlæg		Optisk afbøjning (kant-/objektsporing)		Ja	Ja
Costa (multi-hECT m/ SPoT)		1 million	6	6 cm petriskål		PDMS-indlæg med sorte hætter		optisk afbøjning (objektsporing)		Ja	Ja
Passier (EHT)17		245 K	36	12-brønds plade		PDMS-indlæg med sorte hætter		optisk afbøjning (objektsporing)		Ja	Ja
Vunjak-Novakovic13, 18		1 million	12	6 cm petriskål		PDMS-indlæg med store bogstaver		Optisk afbøjning (kantdetektion)		Ja	Ja
Vunjak-Novakovic (Millisøjle)14		550 K	6	brugerdefineret 6-brønds skål		PDMS-indlæg med store bogstaver		optisk afbøjning (objektsporing); Billeddannelse af calcium		Nej	Ja
Eschenhagen (EHT)10, 19–21		1 million	12	12-brønds plade		PDMS-indlæg med store bogstaver		optisk afbøjning (kantdetektion af efterbøjning); Billeddannelse af calcium		Nej	Ja
Zandstra (CaMiRi)22		25-150 K	96	96-brønds plade		PDMS stolper med kroge		Optisk afbøjning (kantdetektion)		Nej	Ja
Murry23, 24		900 K	24	24-brønds plade		PDMS stolper med hætter, integreret magnet		magnetisk sensor		Nej	Ja
Riget (μTUG)11, 12, 25		Udefineret	156	156-brønd skål		PDMS stolper med hætter, integreret magnet		Optisk sporing (fluorescerende perle)		Ja	Ja

Tabel 1: Karakteristika for nogle lineære konstruerede hjertevævsmodeller i litteraturen. Lineært konstruerede hjertevævsmodeller varierer i størrelse, gennemstrømning, forankringsfunktionsdesign og facilitering af delte mellemstore bade samt kravene til et separat muskelbadsystem til funktionel karakterisering. * Forskerne brugte et kommercielt tilgængeligt konstrueret vævssystem baseret på dimensionerne af en standard 6-brøndplade. ** Et modulært system, hvor enkeltvævsbioreaktorer er forankret til enhver plastkulturskål i det ønskede antal og sted.

Dette papir beskriver den seneste protokol til fremstilling af vores etablerede model af lineært humant manipuleret hjertevæv (hECT)1,2,3,4,5,6,7,8,9,15,27 og metoder til vurdering af hECT’s kontraktile funktion. Hver multivævsbioreaktor rummer op til seks hECT’er i et delt medium bad og består af to “rack” -stykker lavet af silikoneelastomerpolydimethylsiloxan (PDMS) monteret på en stiv polysulfon ramme. Hvert PDMS-rack indeholder seks fleksible integrerede kraftfølerstolper, der er 0,5 mm i diameter og 3,25 mm lange, og tilsammen giver to stativer seks par stolper, som hver rummer en hECT. Inversion af bioreaktoren hjælper med at overvinde enhver hindring for visualisering af hECT’erne nedenfra på grund af vandkondensering fra kulturmediet eller forvrængninger fra menisken i luft-væske-grænsefladen. Hver sammentrækning af en hECT forårsager afbøjning af de integrerede endestolper, og den optiske måling af afbøjningssignalet behandles til en kraft versus tidsregistrering, der repræsenterer den kontraktile funktion af hECT 1,2,3,4,5,6,7,8,9,15,27 . Sammenlignet med de enkeltvævsbioreaktorer, der typisk anvendes til væv af denne størrelse, forbedrer multivævsdesignet den eksperimentelle gennemstrømning og muliggør undersøgelse af parakrin signalering mellem tilstødende væv med potentielt forskellig cellulær sammensætning. Dette system er blevet valideret i offentliggjorte undersøgelser, der beskriver anvendelser i sygdomsmodellering ^4,8, parakrin signalering ^6,7, heterocellulær kultur ^5,9 og terapeutisk screening ^7,9.

I dette system er hECT’erne designet til at være ca. 6 mm lange og 0,5 mm i diameter for at muliggøre robust optisk sporing af kraftmålinger med lav støj. Desuden er aspekter af vævskompleksitet såsom diffusionsgradienter og cellulær organisation afbalanceret med et håndterbart krav på 1 million celler pr. Væv. Med standard CCD-kamerateknologi genererer kræfter så svage som 1 μN (svarende til mindre end 5 μm efter afbøjning) et klart signal, hvilket sikrer, at selv ekstremt svag kontraktil funktion, som observeret med nogle hECT sygdomsmodeller, kan måles nøjagtigt. Dette letter også den detaljerede analyse af trækkraftkurven, hvilket muliggør analyse med højt indhold af op til 16 kontraktilitetsmålinger⁴¹, herunder udviklet kraft, sammentrækningshastigheder (+dF/dt) og afslapning (−dF/dt) og variation i slaghastighed.

Denne protokol begynder med instruktioner til fremstilling af bioreaktorkomponenterne. Der lægges særlig vægt på trinene til at maksimere hECT-udbyttet, reducere teknisk variabilitet i vævsfunktionen og optimere kvaliteten og dybden af vævsvurderingen. De fleste hjertevævstekniske undersøgelser rapporterer ikke om vævstab under fremstilling og langtidstestning, selvom det er en velkendt udfordring på området og reducerer gennemstrømningen og effektiviteten af undersøgelserne²⁷. De vævstekniske metoder, der er beskrevet her, er blevet raffineret gennem årene for at sikre tilbageholdelse af alle hECT’er i de fleste bioreaktorer (uanset hvordan PDMS-stativerne fremstilles). Imidlertid kan selv et tab på 5% -20% af væv påvirke den statistiske effekt betydeligt, især i mindre eksperimenter begrænset af antallet af kardiomyocytter til rådighed (f.eks. På grund af differentieringsudfordringer med nogle syge cellelinjer⁴ eller på grund af de høje omkostninger ved kommercielt købte kardiomyocytter) eller af behandlingstilstanden (f.eks. begrænset tilgængelighed eller høje omkostninger ved forskellige behandlingsforbindelser).

Denne protokol beskriver fremstillingen af stabile posttrackere (SPoTs), en ny funktion i PDMS-stativerne, der fungerer som hætter i enderne af de kraftfølende stolper, der holder hECT’erne²⁷. Det demonstreres, hvordan hættegeometrien reducerer hECT-tabet fra at falde eller trække stolperne af og dermed åbner nye muligheder for dyrkning af hECT’er med en større variation af stivheder og spændinger, som er udfordrende for kulturen på ikke-kappede stolper. Derudover giver SPoT’erne et objekt med høj kontrast for at forbedre den optiske sporing af hECT-sammentrækningen gennem en konsistent og veldefineret form²⁷. Dette efterfølges af en beskrivelse af dyrkning af humant inducerede pluripotente stamceller (iPSC’er) og kardiomyocytdifferentiering baseret på tidligere offentliggjorte protokoller ^3,42,43 og en forklaring af hECT-fabrikation, kultur og funktionelle målinger.

Denne artikel omhandler også behovet for at måle vævsfunktion ved fysiologisk temperatur. Humant myokardium (føtalt såvel som voksent sundt og sygt væv) samt hjertevæv fra en lang række dyrearter (herunder rotter, katte, mus, fritter og kaniner)^44,45 udviser en markant stigning i den frekvensmatchede trækkraft ved temperaturer på 28 °C-32 °C sammenlignet med fysiologisk temperatur – et fænomen kendt som hypotermisk inotropi^{45, 46}. Imidlertid forbliver temperaturens virkninger på konstrueret myokardievævsfunktion underundersøgt. Mange nyere konstruerede hjertevævsmodeller i litteraturen er designet til funktionelt at blive vurderet ved 37 °C for at tilnærme fysiologiske tilstande 13,14,37. Men så vidt vi ved, er de temperaturafhængige virkninger på den kraft, der genereres af manipuleret hjertevæv, ikke blevet systematisk undersøgt. Denne protokol beskriver et pacingelektrodedesign, der minimerer varmetab under test, samt giver mulighed for inkorporering af et isoleret varmeelement i opsætningen til funktionelle målinger, som kan opretholde hECT’erne ved fysiologisk temperatur uden at gå på kompromis med steriliteten²⁷. Vi rapporterer derefter nogle af de observerede effekter af temperatur på hECT-funktionen, herunder på den udviklede kraft, spontan slagfrekvens, +dF / dt og -dF / dt. Alt i alt indeholder dette papir de detaljer, der kræves for at fremstille dette multivævs kraftfølende bioreaktorsystem til fremstilling af humant manipuleret hjertevæv og til vurdering af deres kontraktile funktion, og der præsenteres et sæt data, der giver et sammenligningsgrundlag for målinger ved stuetemperatur og ved 37 °C²⁷.

Protocol

Denne protokol anvendte en afidentificeret iPSC-linje, SkiPS 31.3 (oprindeligt omprogrammeret ved hjælp af dermale fibroblaster fra en sund 45-årig mand)47, og var således undtaget fra specifik godkendelse fra Institutional Review Board i overensstemmelse med institutionens retningslinjer for human forskningsetik. Udfør al celle- og hECT-manipulation under aseptiske forhold i et HEPA-filtreret biologisk sikkerhedskabinet i klasse II eller et laminært flowarbejdsbord. Alle ikke-sterile opløsn…

Representative Results

Efter ovenstående protokol blev kardiomyocytter genereret fra en sund iPSC-linje, der tidligere blev brugt af vores gruppe 9,15 og fremstillet til hECT’er efter 8-61 dage i kultur. Figur 9A viser repræsentative billeder af hECT’er set fra bunden, som blev oprettet uden (øverst) og med (nederste) SPoT’er. Funktionelle målinger blev foretaget ved stuetemperatur (23 °C) og ved fysiologisk temperatur (36 °C) mellem 37 dage og 52 da…

Discussion

Der er talrige lineære manipulerede hjertevævsmodeller offentliggjort i litteraturen, hvoraf nogle er beskrevet i tabel 1. Nogle modeller involverer direkte måling af vævskraften, men disse kræver typisk, at konstruktionen overføres til et separat muskelbad³⁸. De fleste modeller er designet med vævene permanent forankret i begge ender, oftest til PDMS-indlæg 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16 <sup cl…

Materials

0.25 mm diamete 304 Stainless Steel Wire	McMaster Carr	6517K61
0.25% trypsin-EDTA	Gibco	25200056
1.7 mL Microtubes	Axygen	MCT-175-C
10 cm dishes (20 mm tall)	Corning	353003
10 mL Serological Pipette	Drummond	6-000-010
10 N NaOH	Fisher Scientific	SS225-1	dilute 1:10 in sterile distilled water
10X Modified Eagle Medium	Sigma Aldrich	M0275
20 – 200 μL Micropipette	Eppendorf	3123000055
200 μL MicroPipette Tips	VWR	76322-150
5 mL Serological Pipette	Drummond	6-000-005
50 mL Conical Centrifuge Tubes	Falcon	352070
6 cm Petri Dish	Corning	353002
6 Watt LED Dual Gooseneck Illuminator	AmScope	LED-6W
6-Well Plates	Corning	353046
90 degree angle mirror	Edmund Optics	45-594
Acrylic bonding glue	SCIGRIP	#4
Adjustable 10 cm x 10 cm jack	Fisher Scientific	14-673-50
Aluminum 6061	McMaster Carr	9008K82
A-Plan 10X Objective Lens	ZEISS	1020-863
Autoclave Bags	Propper	21002
B-27 supplement	ThermoFisher	17504044
B-27 supplement (without insulin)	ThermoFisher	A1895601
Benchtop Centrifuge	Eppendorf	5810 R
Black ABS	Ultimaker		2.85 mm wide
Bovine Collagen I	Gibco	A1064401
CHIR99021	Tocris	4423
Class II Biosafety Cabinet	Labconco	3430009
Clear Acrylic Sheeting	estreetplastics	1002502436	6.25 mm thick
CNC Vertical Mill	Haas	VF-1
Conductive Graphite Bars	McMaster Carr	1763T33
Dissection microscope	Olympus	SZ61
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 Nutrient Mix	ThermoFisher	11330032
Ethanol	Fisher Scientific	A4094	Dilute to 70% in water
EVE Automated Cell counter	NanoEntek	E1000
EVE Cell Counting Slide	NanoEntek	EVS-050
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	10438026
Fine Curved Forceps	Fine Science Tools	11253-25
Forma Series II Water Jacketed CO2 Incubator	Thermo Electron Corporation	3110	AKA "incubator". With HEPA class 100 filter
Fusion360 software	Autodesk		AKA "CAD software"
Glass Hemocytometer	Reichert	1475	0.1 mm deep
HEPES	Sigma Aldrich	H3784
hESC qualified matrigel	Corning	354277	AKA "basement membrane matrix". Store in frozen aliquots
High Speed CCD Camera	PixelLINK	P7410
Inverted Microscope	Carl Zeiss Werk	Axiovert 40 CFL	10X phase contrast objective
IWR-1	Selleck Chem	S7086
LabView Software	National Instruments	2016
Laminar flow clean bench	NuAire	NU-201-330	necessary for hECT functional analysis
Laptop	AsusTek	Strix	Intel Core i& processor ,CPU 2.8GHz, 16GB RAM
Laser Cutting Machine	Epilog	Helix 24
Magnification headset	ExcelBlades	70020	Recommended for steps requiring fine manipulations
Matlab	Mathworks	Version 2019b or later	AKA "data analysis software"
Micro Vannas Scissors, 3 mm blade	WPI Instruments	501839
Microscope Boom Stand	Olympus	SZ2-STU1
Penicillin-Streptomycin stock solution	ThermoFisher	15140122	10,000 IU/ml penicillin; 10,000 μg/ml streptomycin
Phosphate-buffered saline without divalent cations	Sigma Aldrich	P3813	Diluted in distilled water to 1X and 10X concentrations
Pipette Controller	Drummond	4-000-100
PixelLINK Capture OEM	PixelLINK	10.2.1.6	AKA "Camera Software"
Polysulfone	McMaster Carr	86735K73	translucent amber color
Polytetrafluoroethylene (PTFE)	McMaster Carr	8545K176	Black, molded
ReLeSR	Stem Cell Technologies	5872	AKA "iPSC dissociation media"
Rosewell Park Memorial Institute 1640 Media	ThermoFisher	11875135
Silicone Sheeting	SMI manufacturing		glossy, 0.02 in thickness, durometer 40
Size 10/0 Blue, Green, Red, and Yellow Glass Seed Beads	Michael's		color should withstand autoclaving
Spatula	Fisher Scientific	14-373	used for mixing PDMS
Square Pulse Stimulator	Astro-Med / Grass Technologies	S88X
Stainless Steel Razoblades	GEM	62-0179-CTN	preferred over non-stainless steel due to lower hardness
Stemflex	ThermoFisher	A3349401	AKA "iPSC culture media"
Sterile distilled water	ThermoFisher	5230
Sylgard 170 -  Silicone Elastomer Encapsulant Black 0.9 kg Kit	Dow	DOWSIL 170 2LB KIT	AKA black Polydimethylsiloxane (black PDMS)
Sylgard 184 – Silicone Elastomer Clear 1 lb Kit	Dow	DC 184 SYLGARD 0.5KG 1.1LB KIT	AKA Polydimethylsiloxane (PDMS)
Temperature-controlled heated stage	Okolab	H401-HG-SMU	Set height to 10 cm
Thermoplastic 3D printer	Ultimaker	Ultimaker 3
Thiazovivin	Selleck Chem	S1459
Trypan Blue	NanoEntek	EBT-001
Vacuum Chamber	Bel-Art Parts	F42027-0000
Variable Speed Mini Band Saw	Micro-Mark	82203
Variable Speed Miniature Drill Press	Micro-Mark	82959
Vibration Isolation Table	Labconco	3618000
Weighing Boats	VWR	10803-140
Talon Cylinder Bench Clamp	VWR	97035-528	AKA screw clamp