Entwicklung eines Bioreaktors zur Verbesserung der Datenerfassung und des Modelldurchsatzes von künstlich hergestelltem Herzgewebe

Summary

Dreidimensionale Herzgewebe, die mit aus Stammzellen gewonnenen Kardiomyozyten biotechnologisch hergestellt wurden, haben sich als vielversprechende Modelle für die Untersuchung von gesundem und krankem menschlichem Myokard in vitro erwiesen und gleichzeitig Schlüsselaspekte der nativen Herznische rekapituliert. Dieses Manuskript beschreibt ein Protokoll zur Herstellung und Analyse von High-Content-Kardiomyozyten, die aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen erzeugt werden.

Abstract

Herzinsuffizienz ist nach wie vor die häufigste Todesursache weltweit, was einen dringenden Bedarf an besseren präklinischen Modellen des menschlichen Herzens schafft. Das Tissue Engineering ist für die Grundlagenforschung im Herzen von entscheidender Bedeutung. Die In-vitro-Humanzellkultur eliminiert die Unterschiede zwischen den Spezies von Tiermodellen, während eine gewebeähnlichere 3D-Umgebung (z. B. mit extrazellulärer Matrix und heterozellulärer Kopplung) In-vivo-Bedingungen in größerem Maße simuliert als die herkömmliche zweidimensionale Kultur auf Kunststoff-Petrischalen. Jedes Modellsystem erfordert jedoch spezielle Geräte, z. B. maßgeschneiderte Bioreaktoren und Geräte zur Funktionsbewertung. Darüber hinaus sind diese Protokolle oft kompliziert, arbeitsintensiv und durch das Versagen der kleinen, empfindlichen Gewebe geplagt.

In dieser Arbeit wird ein Verfahren zur Generierung eines robusten Modellsystems für humanes Herzgewebe (hECT) beschrieben, das induzierte pluripotente Kardiomyozyten aus Stammzellen für die longitudinale Messung der Gewebefunktion verwendet. Sechs hECTs mit linearer Streifengeometrie werden parallel kultiviert, wobei jeder hECT an einem Paar kraftempfindlicher Polydimethylsiloxan (PDMS)-Pfosten aufgehängt ist, die an PDMS-Racks befestigt sind. Jeder Beitrag ist mit einem schwarzen PDMS Stable Post Tracker (SPoT) versehen, einer neuen Funktion, die die Benutzerfreundlichkeit, den Durchsatz, die Geweberetention und die Datenqualität verbessert. Die Form ermöglicht eine zuverlässige optische Nachführung von Pfostenauslenkungen und führt zu verbesserten Zuckungskraftverfolgungen mit absoluter aktiver und passiver Spannung. Die Kappengeometrie eliminiert Gewebeversagen aufgrund von hECTs, die von den Pfosten rutschen, und da sie einen zweiten Schritt nach der Herstellung des PDMS-Racks erfordern, können die SPoTs ohne größere Änderungen am Herstellungsprozess des Bioreaktors zu bestehenden PDMS-Pfostendesigns hinzugefügt werden.

Das System wird verwendet, um die Bedeutung der Messung der hECT-Funktion bei physiologischen Temperaturen zu demonstrieren und zeigt eine stabile Gewebefunktion während der Datenerfassung. Zusammenfassend beschreiben wir ein hochmodernes Modellsystem, das wichtige physiologische Bedingungen reproduziert, um die Biotreue, Effizienz und Strenge von künstlich hergestelltem Herzgewebe für In-vitro-Anwendungen zu verbessern.

Introduction

Technisch hergestellte Herzgewebemodelle gibt es in einer Vielzahl von Geometrien und Konfigurationen, um verschiedene Aspekte der nativen Herznische zu rekapitulieren, die mit herkömmlichen zweidimensionalen Zellkulturen nur schwer zu erreichen sind. Eine der gebräuchlichsten Konfigurationen ist der lineare Gewebestreifen mit flexiblen Ankern an jedem Ende^, um die Selbstorganisation des Gewebes zu induzieren und das Gewebe mit einer definierten Vorspannung und einem Auslesen der resultierenden Zuckungskräfte 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 zu versorgen. 12,13,14,15,16,17,18,19,20,21
^,22,23,24,25,26,27. Die erzeugte Kraft kann durch die optische Nachführung der Gewebeverkürzung und unter Verwendung der elastischen Strahltheorie zur Berechnung der Kraft aus den gemessenen Durchbiegungen und der Federkonstante der Anker 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 robust bestimmt werden^. 12,13,14,15,16,17,18,19,20^,
21,22,25,26,28.

Das kardiale Tissue Engineering ist jedoch immer noch ein sich entwickelndes Feld, und einige Herausforderungen bleiben bestehen. Für jedes Modellsystem sind spezielle Geräte, wie z. B. maßgeschneiderte Bioreaktoren und Funktionsbewertungsgeräte, erforderlich 10,29,30,31. Die Größe und Komplexität der Mikroumgebung dieser Konstrukte wird oft durch einen geringen Durchsatz aufgrund arbeitsintensiver Protokolle, einer hohen Anzahl von Zellen und der Zerbrechlichkeit des Gewebes begrenzt. Um dieses Problem anzugehen, haben sich einige Gruppen der Herstellung von Mikrogeweben zugewandt, die nur Hunderte oder Tausende von Zellen enthalten, um Hochdurchsatz-Assays zu ermöglichen, die für die Arzneimittelforschung nützlich sind. Diese reduzierte Skala erschwert jedoch die genaue Beurteilung der Funktion¹², eliminiert Schlüsselaspekte der nativen kardialen Nische (wie Nährstoff-/Sauerstoffdiffusionsgradienten und komplexe Architektur³⁶) und begrenzt die Menge an Material, die für die anschließende molekulare und strukturelle Analyse zur Verfügung steht (was oft eine Bündelung der Gewebe erfordert). Tabelle 1 fasst einige der Konfigurationen von linearen Gewebestreifenmodellen in der Literatur zusammen 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15^, 16,17,18,19,20^,
21,22,23,24,25,26,37,38,39,40.

Gruppe		Zellen pro Gewebe	Gewebe pro Platte	Plattenformat		Verankerungsfunktion		Verfahren zur funktionalen Datenerfassung		Geteilte Medienbad?	Funktionelle Maßnahme- ment in situ?
Yoshida (ECT)38		4 Millionen	6	Modifizierte 6-Well-Platte*		Kraftaufnehmer		Direkte Kraftmessung		Nein	Nein
Chan (hESC-CM-ECTs)26		310 Tsd.	6	Benutzerdefinierte 6-Well-Schale		PDMS-Beiträge		Direkte Kraftmessung		ja	Nein
Feinberg (dyn-EHT)16		1,5 Millionen	6	Benutzerdefinierte 6-Well-Schale		PDMS-Draht		Form des Gewebes		Nein	ja
RADISIC (BioWire)39, 40		110 Tsd.	8			Polymer-Draht		Form des Drahtes		ja	ja
Costa (einzelne hECT)1, 2		1-2 Millionen	4**	10 cm Petrischale**		PDMS-Beiträge		Optische Ablenkung (Kanten-/Objektverfolgung)		ja	ja
Costa (multi-hECT)3–9		500 Tsd.-1 Mio.	6	6 cm Petrischale		PDMS-Beiträge		Optische Ablenkung (Kanten-/Objektverfolgung)		ja	ja
Costa (Multi-hECT mit SPoT)		1 Million	6	6 cm Petrischale		PDMS-Pfosten mit schwarzen Kappen		Optische Ablenkung (Objektverfolgung)		ja	ja
Passier (EHT)17		245 Tsd.	36	12-Well-Platte		PDMS-Pfosten mit schwarzen Kappen		Optische Ablenkung (Objektverfolgung)		ja	ja
Vunjak-Novakovic13, 18		1 Million	12	6 cm Petrischale		PDMS-Pfosten mit Kappen		Optische Ablenkung (Kantenerkennung)		ja	ja
Vunjak-Novakovic (MilliPillar)14		550 Tsd.	6	Benutzerdefinierte 6-Well-Schale		PDMS-Pfosten mit Kappen		optische Ablenkung (Objektverfolgung); Kalzium-Bildgebung		Nein	ja
Eschenhagen (EHT)10, 19–21		1 Million	12	12-Well-Platte		PDMS-Pfosten mit Kappen		optische Durchbiegung (Kantenerkennung der Nachbiegung); Kalzium-Bildgebung		Nein	ja
Zandstra (CaMiRi)22		25-150 Tsd.	96	96-Well-Platte		PDMS-Pfosten mit Haken		Optische Ablenkung (Kantenerkennung)		Nein	ja
Murry23, 24		900 Tsd.	24	24-Well-Platte		PDMS-Pfosten mit Kappen, integrierter Magnet		Magnetischer Sensor		Nein	ja
Reich (μTUG)11, 12, 25		undefiniert	156	156-Well-Schale		PDMS-Pfosten mit Kappen, integrierter Magnet		Optisches Tracking (fluoreszierende Perle)		ja	ja

Tabelle 1: Charakteristika einiger linear konstruierter kardialer Gewebemodelle in der Literatur. Linear konstruierte kardiale Gewebemodelle unterscheiden sich in Größe, Durchsatz, Verankerungsmerkmalsdesign und der Erleichterung gemeinsamer Medienbäder sowie in den Anforderungen an ein separates Muskelbadsystem zur funktionellen Charakterisierung. * Die Forscher verwendeten ein kommerziell erhältliches Gewebesystem, das auf den Abmessungen einer Standard-6-Well-Platte basiert. ** Ein modulares System, bei dem Einzelgewebe-Bioreaktoren in der gewünschten Anzahl und an der gewünschten Stelle an jeder Kunststoffkulturschale verankert werden.

In diesem Artikel wird das neueste Protokoll für die Herstellung unseres etablierten Modells des linearen humanen Herzgewebes (hECT) beschrieben1,2,3,4,5,6,7,8,9,15,27 und Methoden zur Beurteilung der kontraktilen hECT-Funktion. Jeder Multi-Tissue-Bioreaktor beherbergt bis zu sechs hECTs in einem gemeinsamen Mediumbad und besteht aus zwei “Rack”-Stücken aus dem Silikonelastomer Polydimethylsiloxan (PDMS), die auf einem starren Polysulfonrahmen montiert sind. Jedes PDMS-Rack enthält sechs flexible, integrierte Force-Sensing-Pfosten mit einem Durchmesser von 0,5 mm und einer Länge von 3,25 mm, und zusammen bieten zwei Racks sechs Pfostenpaare, von denen jedes einen hECT fasst. Die Inversion des Bioreaktors trägt dazu bei, jegliche Behinderung der Visualisierung der hECTs von unten durch Wasserkondensation aus dem Nährmedium oder Verzerrungen der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche durch den Meniskus zu überwinden. Jede Kontraktion eines hECT bewirkt eine Auslenkung der integrierten Endpfosten, und die optische Messung des Auslenkungssignals wird zu einer Kraft-Zeit-Verfolgung verarbeitet, die die kontraktile Funktion des hECT^darstellt 1,2,3,4,5,6,7,8,9,15,27 . Im Vergleich zu den Einzelgewebe-Bioreaktoren, die typischerweise für Gewebe dieser Größe verwendet werden, verbessert das Multi-Gewebe-Design den experimentellen Durchsatz und ermöglicht die Untersuchung der parakrinen Signalübertragung zwischen benachbarten Geweben mit potenziell unterschiedlicher zellulärer Zusammensetzung. Dieses System wurde in veröffentlichten Studien validiert, die Anwendungen in der Krankheitsmodellierung ^4,8, der parakrinen Signaltransduktion ^6,7, der heterozellulären Kultur ^5,9 und dem therapeutischen Screening ^7,9 beschreiben.

In diesem System sind die hECTs auf eine Länge von ca. 6 mm und einen Durchmesser von 0,5 mm ausgelegt, um eine robuste optische Verfolgung von Kraftmessungen mit geringem Rauschen zu ermöglichen. Darüber hinaus werden Aspekte der Gewebekomplexität, wie z.B. Diffusionsgradienten und zelluläre Organisation, mit einem überschaubaren Bedarf von 1 Million Zellen pro Gewebe ausgeglichen. Mit der Standard-CCD-Kameratechnologie erzeugen Kräfte von nur 1 μN (d. h. weniger als 5 μm nach der Ablenkung) ein klares Signal, das sicherstellt, dass selbst eine extrem schwache kontraktile Funktion, wie sie bei einigen hECT-Krankheitsmodellen beobachtet wurde, genau gemessen werden kann. Dies erleichtert auch die detaillierte Analyse der Zuckungskraftkurve und ermöglicht so die High-Content-Analyse von bis zu 16 Kontraktilitätsmetriken⁴¹, einschließlich der entwickelten Kraft, der Kontraktionsraten (+dF/dt) und der Relaxationsraten (−dF/dt) sowie der Schwebungsratenvariabilität.

Dieses Protokoll beginnt mit einer Anleitung zur Herstellung der Bioreaktorkomponenten. Besonderes Augenmerk wird auf die Schritte zur Maximierung der hECT-Ausbeute, zur Reduzierung der technischen Variabilität in der Gewebefunktion und zur Optimierung der Qualität und Tiefe der Gewebebeurteilung gelegt. Die meisten kardialen Tissue-Engineering-Studien berichten nicht über Raten von Gewebeverlusten während der Herstellung und Langzeittests, obwohl dies eine bekannte Herausforderung auf diesem Gebiet darstellt und den Durchsatz und die Effizienz der Studien verringert²⁷. Die hier beschriebenen Tissue-Engineering-Methoden wurden im Laufe der Jahre verfeinert, um sicherzustellen, dass alle hECTs in den meisten Bioreaktoren erhalten bleiben (unabhängig davon, wie die PDMS-Racks hergestellt werden). Allerdings kann selbst ein Gewebeverlust von 5%-20% die statistische Aussagekraft signifikant beeinflussen, insbesondere in kleineren Experimenten, die durch die Anzahl der verfügbaren Kardiomyozyten begrenzt sind (z. B. aufgrund von Differenzierungsproblemen mit einigen erkrankten Zelllinien⁴ oder aufgrund der hohen Kosten kommerziell erworbener Kardiomyozyten) oder durch den Behandlungszustand (z. B. begrenzte Verfügbarkeit oder hohe Kosten verschiedener Behandlungsverbindungen).

Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung von stabilen Post-Trackern (SPoTs), ein neues Merkmal der PDMS-Racks, die als Kappen an den Enden der Kraftmesspfosten fungieren, die die hECTs²⁷ halten. Es wird gezeigt, wie die Kappengeometrie den hECT-Verlust durch Herunterfallen oder Abziehen der Pfosten signifikant reduziert und so neue Möglichkeiten für die Kultivierung von hECTs mit einer größeren Vielfalt an Steifigkeiten und Spannungen eröffnet, die für die Kultivierung auf unverschlossenen Pfosten eine Herausforderung darstellen. Zusätzlich stellen die SPoTs ein kontrastreiches Objekt bereit, um die optische Verfolgung der hECT-Kontraktion durch eine konsistente und gut definierte Form²⁷ zu verbessern. Darauf folgt eine Beschreibung der Kultivierung humaner induzierter pluripotenter Stammzellen (iPSCs) und der Kardiomyozytendifferenzierung auf der Grundlage der zuvor veröffentlichten Protokolle ^3,42,43 sowie eine Erläuterung der hEKT-Herstellung, Kultur und funktionellen Messungen.

Dieser Artikel befasst sich auch mit der Notwendigkeit, die Gewebefunktion bei physiologischer Temperatur zu messen. Menschliches Myokard (sowohl fötales als auch adultes gesundes und krankes Gewebe) sowie Herzgewebe einer Vielzahl von Tierarten (einschließlich Ratten, Katzen, Mäusen, Frettchen und Kaninchen)^44,45 zeigt einen deutlichen Anstieg der frequenzangepassten Zuckungskraft bei Temperaturen von 28 °C bis 32 °C im Vergleich zur physiologischen Temperatur – ein Phänomen, das als hypotherme Inotropie bekannt ist^{45, 46}. S. Die Auswirkungen der Temperatur auf die Funktion des künstlich hergestellten Myokardgewebes sind jedoch noch nicht ausreichend untersucht. Viele neuere kardiale Gewebemodelle in der Literatur sind so konzipiert, dass sie bei 37 °C funktionell beurteilt werden können, um sich den physiologischen Bedingungen anzunähern 13,14,37. Unseres Wissens sind die temperaturabhängigen Auswirkungen auf die Kraft, die von künstlich hergestelltem Herzgewebe erzeugt wird, jedoch nicht systematisch untersucht worden. Dieses Protokoll beschreibt ein Stimulationselektrodendesign, das den Wärmeverlust während der Prüfung minimiert und den Einbau eines isolierten Heizelements in den Aufbau für Funktionsmessungen ermöglicht, das die hECTs auf physiologischer Temperatur halten kann, ohne die Sterilität zu beeinträchtigen²⁷. Wir berichten dann über einige der beobachteten Auswirkungen der Temperatur auf die hEKT-Funktion, einschließlich der entwickelten Kraft, der spontanen Schlagfrequenz, +dF/dt und −dF/dt. Insgesamt enthält diese Arbeit die Details, die für die Herstellung dieses Multi-Gewebe-Kraftsensor-Bioreaktorsystems zur Herstellung von humanem Herzgewebe und zur Bewertung ihrer kontraktilen Funktion erforderlich sind, und es wird ein Datensatz präsentiert, der eine Vergleichsgrundlage für Messungen bei Raumtemperatur und bei 37 °C bietet²⁷.

Protocol

Dieses Protokoll verwendete eine anonymisierte iPSC-Linie, SkiPS 31.3 (ursprünglich mit dermalen Fibroblasten eines gesunden 45-jährigen Mannes umprogrammiert)47 und war daher in Übereinstimmung mit den Richtlinien der Ethikkommission für die Humanforschung der Institution von der spezifischen Genehmigung durch das Institutional Review Board ausgenommen. Führen Sie die gesamte Zell- und hECT-Manipulation unter aseptischen Bedingungen in einer HEPA-gefilterten biologischen Sicherheitswerkbank …

Representative Results

Nach dem oben genannten Protokoll wurden Kardiomyozyten aus einer gesunden iPSC-Linie generiert, die zuvor von unserer Gruppe 9,15 verwendet wurde, und nach 8-61 Tagen in Kultur zu hECTs fabriziert. Abbildung 9A zeigt repräsentative Bilder von hECTs von unten, die ohne (oben) und mit (unten) SPoTs erstellt wurden. Die funktionellen Messungen wurden bei Raumtemperatur (23 °C) und bei physiologischer Temperatur (36 °C) zwischen 37 u…

Discussion

In der Literatur sind zahlreiche linear hergestellte kardiale Gewebemodelle veröffentlicht, von denen einige in Tabelle 1 beschrieben sind. Einige Modelle beinhalten die direkte Messung der Gewebekraft, aber diese erfordern typischerweise die Übertragung des Konstrukts in ein separates Muskelbad³⁸. Bei den meisten Modellen ist das Gewebe an beiden Enden dauerhaft verankert, am häufigsten an den PDMS-Pfosten 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,…

Materials

0.25 mm diamete 304 Stainless Steel Wire	McMaster Carr	6517K61
0.25% trypsin-EDTA	Gibco	25200056
1.7 mL Microtubes	Axygen	MCT-175-C
10 cm dishes (20 mm tall)	Corning	353003
10 mL Serological Pipette	Drummond	6-000-010
10 N NaOH	Fisher Scientific	SS225-1	dilute 1:10 in sterile distilled water
10X Modified Eagle Medium	Sigma Aldrich	M0275
20 – 200 μL Micropipette	Eppendorf	3123000055
200 μL MicroPipette Tips	VWR	76322-150
5 mL Serological Pipette	Drummond	6-000-005
50 mL Conical Centrifuge Tubes	Falcon	352070
6 cm Petri Dish	Corning	353002
6 Watt LED Dual Gooseneck Illuminator	AmScope	LED-6W
6-Well Plates	Corning	353046
90 degree angle mirror	Edmund Optics	45-594
Acrylic bonding glue	SCIGRIP	#4
Adjustable 10 cm x 10 cm jack	Fisher Scientific	14-673-50
Aluminum 6061	McMaster Carr	9008K82
A-Plan 10X Objective Lens	ZEISS	1020-863
Autoclave Bags	Propper	21002
B-27 supplement	ThermoFisher	17504044
B-27 supplement (without insulin)	ThermoFisher	A1895601
Benchtop Centrifuge	Eppendorf	5810 R
Black ABS	Ultimaker		2.85 mm wide
Bovine Collagen I	Gibco	A1064401
CHIR99021	Tocris	4423
Class II Biosafety Cabinet	Labconco	3430009
Clear Acrylic Sheeting	estreetplastics	1002502436	6.25 mm thick
CNC Vertical Mill	Haas	VF-1
Conductive Graphite Bars	McMaster Carr	1763T33
Dissection microscope	Olympus	SZ61
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 Nutrient Mix	ThermoFisher	11330032
Ethanol	Fisher Scientific	A4094	Dilute to 70% in water
EVE Automated Cell counter	NanoEntek	E1000
EVE Cell Counting Slide	NanoEntek	EVS-050
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	10438026
Fine Curved Forceps	Fine Science Tools	11253-25
Forma Series II Water Jacketed CO2 Incubator	Thermo Electron Corporation	3110	AKA "incubator". With HEPA class 100 filter
Fusion360 software	Autodesk		AKA "CAD software"
Glass Hemocytometer	Reichert	1475	0.1 mm deep
HEPES	Sigma Aldrich	H3784
hESC qualified matrigel	Corning	354277	AKA "basement membrane matrix". Store in frozen aliquots
High Speed CCD Camera	PixelLINK	P7410
Inverted Microscope	Carl Zeiss Werk	Axiovert 40 CFL	10X phase contrast objective
IWR-1	Selleck Chem	S7086
LabView Software	National Instruments	2016
Laminar flow clean bench	NuAire	NU-201-330	necessary for hECT functional analysis
Laptop	AsusTek	Strix	Intel Core i& processor ,CPU 2.8GHz, 16GB RAM
Laser Cutting Machine	Epilog	Helix 24
Magnification headset	ExcelBlades	70020	Recommended for steps requiring fine manipulations
Matlab	Mathworks	Version 2019b or later	AKA "data analysis software"
Micro Vannas Scissors, 3 mm blade	WPI Instruments	501839
Microscope Boom Stand	Olympus	SZ2-STU1
Penicillin-Streptomycin stock solution	ThermoFisher	15140122	10,000 IU/ml penicillin; 10,000 μg/ml streptomycin
Phosphate-buffered saline without divalent cations	Sigma Aldrich	P3813	Diluted in distilled water to 1X and 10X concentrations
Pipette Controller	Drummond	4-000-100
PixelLINK Capture OEM	PixelLINK	10.2.1.6	AKA "Camera Software"
Polysulfone	McMaster Carr	86735K73	translucent amber color
Polytetrafluoroethylene (PTFE)	McMaster Carr	8545K176	Black, molded
ReLeSR	Stem Cell Technologies	5872	AKA "iPSC dissociation media"
Rosewell Park Memorial Institute 1640 Media	ThermoFisher	11875135
Silicone Sheeting	SMI manufacturing		glossy, 0.02 in thickness, durometer 40
Size 10/0 Blue, Green, Red, and Yellow Glass Seed Beads	Michael's		color should withstand autoclaving
Spatula	Fisher Scientific	14-373	used for mixing PDMS
Square Pulse Stimulator	Astro-Med / Grass Technologies	S88X
Stainless Steel Razoblades	GEM	62-0179-CTN	preferred over non-stainless steel due to lower hardness
Stemflex	ThermoFisher	A3349401	AKA "iPSC culture media"
Sterile distilled water	ThermoFisher	5230
Sylgard 170 -  Silicone Elastomer Encapsulant Black 0.9 kg Kit	Dow	DOWSIL 170 2LB KIT	AKA black Polydimethylsiloxane (black PDMS)
Sylgard 184 – Silicone Elastomer Clear 1 lb Kit	Dow	DC 184 SYLGARD 0.5KG 1.1LB KIT	AKA Polydimethylsiloxane (PDMS)
Temperature-controlled heated stage	Okolab	H401-HG-SMU	Set height to 10 cm
Thermoplastic 3D printer	Ultimaker	Ultimaker 3
Thiazovivin	Selleck Chem	S1459
Trypan Blue	NanoEntek	EBT-001
Vacuum Chamber	Bel-Art Parts	F42027-0000
Variable Speed Mini Band Saw	Micro-Mark	82203
Variable Speed Miniature Drill Press	Micro-Mark	82959
Vibration Isolation Table	Labconco	3618000
Weighing Boats	VWR	10803-140
Talon Cylinder Bench Clamp	VWR	97035-528	AKA screw clamp