मानव आर्टिकुलर कार्टिलेज खोजों पर परमाणु बल माइक्रोस्कोपी-आधारित माइक्रो-इंडेंटेशन में व्यावहारिक मुद्दों को संबोधित करना
Summary
हम परमाणु बल माइक्रोस्कोपी माइक्रो-इंडेंटेशन से जुड़ी सबसे आम समस्याओं की पहचान करने और उन्हें संबोधित करने के लिए एक चरण-दर-चरण दृष्टिकोण प्रस्तुत करते हैं। हम पुराने ऑस्टियोआर्थराइटिस-संचालित अध: पतन के विभिन्न डिग्री की विशेषता वाले देशी मानव आर्टिकुलर कार्टिलेज खोजों पर उभरती समस्याओं का उदाहरण देते हैं।
Abstract
बिना किसी संदेह के, परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (एएफएम) वर्तमान में जैविक क्षेत्र में सूक्ष्म और यहां तक कि नैनो-संकेतों का आकलन करने के लिए सबसे शक्तिशाली और उपयोगी तकनीकों में से एक है। हालांकि, किसी भी अन्य सूक्ष्म दृष्टिकोण के साथ, पद्धति संबंधी चुनौतियां उत्पन्न हो सकती हैं। विशेष रूप से, नमूने की विशेषताओं, नमूना तैयारी, उपकरण के प्रकार और इंडेंटेशन जांच अवांछित कलाकृतियों को जन्म दे सकती है। इस प्रोटोकॉल में, हम स्वस्थ और साथ ही ऑस्टियोआर्थ्रिटिक आर्टिकुलर कार्टिलेज खोजों पर इन उभरते मुद्दों का उदाहरण देते हैं। इसके लिए, हम पहले एक चरण-दर-चरण दृष्टिकोण के माध्यम से दिखाते हैं कि पूरे ऊतक खोजों के बड़े 2 डी मोज़ेक फ्लोरेसेंस इमेजिंग के माध्यम से अपघटन के विभिन्न चरणों के अनुसार एक्स विवो आर्टिकुलर कार्टिलेज डिस्क को कैसे उत्पन्न, ग्रेड और नेत्रहीन रूप से वर्गीकृत किया जाए। एक्स विवो मॉडल की प्रमुख ताकत यह है कि इसमें वृद्ध, देशी, मानव उपास्थि शामिल हैं जो शुरुआती शुरुआत से प्रगति तक पुराने ऑस्टियोआर्थराइटिस से संबंधित परिवर्तनों की जांच की अनुमति देता है। इसके अलावा, ऊतक तैयारी में सामान्य नुकसान, साथ ही बाद के डेटा विश्लेषण के साथ वास्तविक एएफएम प्रक्रिया भी प्रस्तुत की जाती है। हम दिखाते हैं कि नमूना तैयारी और प्रसंस्करण, उन्नत अध: पतन के कारण स्थलाकृतिक नमूना विशेषताओं और नमूना-टिप इंटरैक्शन जैसे बुनियादी लेकिन महत्वपूर्ण कदम डेटा अधिग्रहण को कैसे प्रभावित कर सकते हैं। हम एएफएम में सबसे आम समस्याओं की जांच के अधीन भी हैं और वर्णन करते हैं, जहां संभव हो, उन्हें कैसे दूर किया जाए। इन सीमाओं का ज्ञान सही डेटा अधिग्रहण, व्याख्या और अंततः, निष्कर्षों को व्यापक वैज्ञानिक संदर्भ में एम्बेड करने के लिए अत्यंत महत्वपूर्ण है।
Introduction
इलेक्ट्रॉनिक उपकरणों और प्रणालियों के लगातार सिकुड़ते आकार के कारण, सूक्ष्म और नैनो-आधारित प्रौद्योगिकी और उपकरणों के तेजी से विकास ने गति प्राप्त की है। ऐसा ही एक उपकरण परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (एएफएम) है, जो जैविक सतहों को स्कैन कर सकता है और नैनो- और माइक्रोमीटरस्केल 1,2 दोनों पर स्थलाकृतिक या बायोमैकेनिकल जानकारी प्राप्त कर सकता है। इसकी विशाल विशेषताओं के बीच, इस उपकरण को विभिन्न जैविक प्रणालियों 3,4,5,6 के यांत्रिक गुणों के बारे में जानकारी प्राप्त करने के लिए एक सूक्ष्म के साथ-साथ एक नैनो-इंडेंटर के रूप में संचालित किया जा सकता है। डेटा एक यांत्रिक जांच के माध्यम से सतह के साथ भौतिक संपर्क द्वारा एकत्र किया जाता है, जो इसकी टिप7 पर लगभग 1 एनएम जितना छोटा हो सकता है। नमूने के परिणामस्वरूप विरूपण तब कैंटिलीवर टिप की इंडेंटेशन गहराई और नमूना8 पर लागू बल के आधार पर प्रदर्शित किया जाता है।
ऑस्टियोआर्थराइटिस (ओए) एक दीर्घकालिक अपक्षयी पुरानी बीमारी है जो जोड़ों और आसपास के ऊतकों में आर्टिकुलर कार्टिलेज की गिरावट की विशेषता है, जिससे हड्डी की सतहों का पूरा संपर्क हो सकता है। ओए का बोझ पर्याप्त है; वर्तमान में, सभी महिलाओं में से आधे और 65 वर्ष और उससे अधिक आयु के सभी पुरुषों में से एक तिहाई ओए9 से पीड़ित हैं। आघात, मोटापा, और संयुक्त10 के परिणामस्वरूप परिवर्तित बायोमैकेनिक्स आर्टिकुलर कार्टिलेज अपघटन को निर्धारित करते हैं, जिसे एक सामान्य अंतिम परिणाम के रूप में देखा जाता है। गैंज़ एट अल के अग्रणी अध्ययन ने माना कि ओए प्रक्रिया के शुरुआती चरणों में उपास्थि11 के बायोमैकेनिकल गुण शामिल हो सकते हैं, और तब से शोधकर्ताओं ने इस परिकल्पना12 की पुष्टि की है। इसी तरह, यह आम तौर पर स्वीकार किया जाता है कि ऊतक के बायोमैकेनिकल गुण कार्यात्मक रूप से अल्ट्रास्ट्रक्चरल संगठन के साथ-साथ सेल-सेल और सेल-मैट्रिक्स क्रॉसस्टॉक द्वारा व्यवस्थित होते हैं। कोई भी परिवर्तन नाटकीय रूप से समग्र ऊतक बायोमैकेनिकलकामकाज को प्रभावित कर सकता है। आज तक, ओए निदान नैदानिक है और सादे फिल्म रेडियोग्राफी14 पर आधारित है। यह दृष्टिकोण दो तरफा है: सबसे पहले, ओए के निदान को तैयार करने के लिए परिभाषित अपक्षयी कट-ऑफ सीमा की कमी से स्थिति को निर्धारित करना मुश्किल हो जाता है, और, दूसरी बात, इमेजिंग विधियों में संवेदनशीलता और मानकीकरण की कमी होती है और स्थानीयकृत उपास्थि क्षति15,16,17 का पता नहीं लगा सकते हैं। इसके लिए, उपास्थि के यांत्रिक गुणों के मूल्यांकन का निर्णायक लाभ है कि यह एक पैरामीटर का वर्णन करता है जो रोग के एटियलजि की परवाह किए बिना ओए के दौरान बदलता है और बहुत प्रारंभिक चरण में ऊतक कार्यक्षमता पर सीधा प्रभाव पड़ता है। इंडेंटेशन उपकरण उस बल को मापते हैं जिसके द्वारा ऊतक इंडेंटेशन का विरोध करता है। यह वास्तव में, एक नई अवधारणा नहीं है; सबसे शुरुआती अध्ययन 1980 और 1990 के दशक के हैं। इस अवधि में, कई अध्ययनों ने सुझाव दिया कि आर्टिकुलर कार्टिलेज के आर्थोस्कोपिक माप के लिए डिज़ाइन किए गए इंडेंटेशन उपकरण उपास्थि में अपक्षयी परिवर्तनों का पता लगाने के लिए अच्छी तरह से अनुकूल हो सकते हैं। यहां तक कि 30 साल पहले, कुछ अध्ययन यह प्रदर्शित करने में सक्षम थे कि इंडेंटेशन उपकरण आर्थ्रोस्कोपी 18,19,20 के दौरान संपीड़ित कठोरता माप का संचालन करके ऊतक अध: पतन के दौरान उपास्थि की सतह में विवो परिवर्तनों का पता लगाने में सक्षम थे।
आर्टिकुलर कार्टिलेज का एएफएम इंडेंटेशन (एएफएम-आईटी) ऊतक की एक महत्वपूर्ण यांत्रिक संपत्ति, अर्थात् कठोरता के बारे में जानकारी प्रदान करता है। यह एक यांत्रिक पैरामीटर है जो एक लागू, गैर-विनाशकारी भार और इंडेंटेड ऊतक क्षेत्र21 के परिणामी विरूपण के बीच संबंध का वर्णन करता है। एएफएम-आईटी को मैक्रोस्कोपिक रूप से अप्रभावित कोलेजन नेटवर्क में कठोरता में आयु-निर्भर संशोधनों को निर्धारित करने में सक्षम दिखाया गया है, इस प्रकार, ओए शुरुआत (आर्टिकुलर कार्टिलेज में आउटरब्रिज स्केल पर ग्रेड 0) से जुड़े पैथोलॉजिकल परिवर्तनों के बीच अंतर करना। हमने पहले दिखाया है कि एएफएम-आईटी, प्रारंभिक उपास्थि अध: पतन के लिए एक छवि-आधारित बायोमार्कर के रूप में स्थानिक चोंड्रोसाइट्स संगठन के आधार पर, न केवल मात्रा निर्धारित करने की अनुमति देते हैं, बल्कि वास्तव में शुरुआती अपक्षयी यांत्रिक परिवर्तनों को भी इंगित करते हैं। इन निष्कर्षों की पुष्टि पहले हीअन्य 23,24 द्वारा की जा चुकी है। इसलिए, एएफएम-आईटी प्रारंभिक अपक्षयी परिवर्तनों का निदान और पहचान करने के लिए एक दिलचस्प उपकरण के रूप में कार्य करता है। इन परिवर्तनों को पहले से ही सेलुलर स्तर पर मापा जा सकता है, ओए पैथोफिजियोलॉजिकल प्रक्रिया की समझ को फिर से आकार दिया जा सकता है।
इस प्रोटोकॉल में, हम मूल उपास्थि खोज तैयारी से लेकर एएफएम डेटा अधिग्रहण और प्रसंस्करण तक, आर्टिकुलर कार्टिलेज खोजों की एक पूर्ण हिस्टोलॉजिकल और बायोमैकेनिकल ग्रेडिंग प्रक्रिया का प्रदर्शन करते हैं। एक चरण-दर-चरण दृष्टिकोण के माध्यम से, हम दिखाते हैं कि 2 डी बड़े मोज़ेक इमेजिंग के माध्यम से अध: पतन के विभिन्न चरणों के अनुसार आर्टिकुलर कार्टिलेज ऊतक को कैसे उत्पन्न, ग्रेड और नेत्रहीन रूप से वर्गीकृत किया जाए, इसके बाद माइक्रो-एएफएम इंडेंटेशन।
हालांकि, वर्तमान में, एएफएम-आईटी कार्टिलेज7 में बायोमैकेनिकल परिवर्तनों को मापने के लिए सबसे संवेदनशील उपकरणों में से एक है, किसी भी अन्य वाद्य तकनीक की तरह, इसकी सीमाएं और व्यावहारिक विशिष्टताएं25 हैं जो गलत डेटा अधिग्रहण का कारण बन सकती हैं। इसके लिए, हम उपास्थि खोजों के एएफएम माप के दौरान उत्पन्न होने वाली सबसे आम समस्याओं की जांच के अधीन हैं और वर्णन करते हैं, जहां संभव हो, उन्हें कैसे कम या दूर किया जाए। इनमें नमूनों के स्थलाकृतिक पहलू और एएफएम-संगत वातावरण में उन्हें स्थिर करने में कठिनाइयां, ऊतक की सतह की भौतिक विशिष्टताएं और ऐसी सतहों पर एएफएम माप करने में परिणामी कठिनाइयां शामिल हैं। गलत बल-दूरी वक्रों के उदाहरण भी प्रस्तुत किए गए हैं, जो उन स्थितियों पर जोर देते हैं जो उनके कारण हो सकते हैं। कैंटिलीवर टिप की ज्यामिति में निहित अतिरिक्त सीमाओं और डेटा विश्लेषण के लिए हर्ट्ज मॉडल के उपयोग पर भी चर्चा की गई है।
Protocol
Representative Results
Discussion
एक प्रगतिशील और बहुक्रियात्मक बीमारी के रूप में, ओए आर्टिकुलर कार्टिलेज में संरचनात्मक और कार्यात्मक परिवर्तनों को ट्रिगर करता है। ओए के दौरान, यांत्रिक विशेषताओं में हानि आर्टिकुलर कार्टिलेज<sup class="x…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम ऊतक के नमूने प्रदान करने के लिए तुएबिंगन विश्वविद्यालय अस्पताल के आर्थोपेडिक सर्जरी विभाग के आर्थोपेडिक सर्जनों को धन्यवाद देते हैं।
Materials
| Amphotericin B | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 1397-89-3 | |
| Atomic force microscop (AFM) head | CellHesion 200, Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany | JPK00518 | |
| Biocompatible sample glue | Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany | H000033 | |
| Calcein AM | Cayman, Ann Arbor, Michigan, USA | 14948 | Cell membrane permeable stain, used for cartilage disc sorting- top view imaging |
| Cantilever | Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany | SAA-SPH-5UM | Frequency Nom: 30KHz, k: 0.2N/m, lenght nom: 115μm, width nom: 40μm, geometry: rectangular, cylindrical tip with a 5μm end radius |
| Cartilage ctting device | Self-made | n/a | Cutting plastic device containing predefined wholes of 4mmx1mm |
| CDD camera integrated in the AFM | The Imaging Source Europe GmbH, Bremen, Germany | DFK 31BF03 | |
| CDD camera integrated in the fluorescence microscope | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany | DFC3000G | |
| Cryotome | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany | CM3050S | |
| Data Processing Software for the AFM | Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany | n/a | Version 5.0.86, can be downloaded for free from the following website https://customers.jpk.com |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) | Gibco, Life Technologies, Darmstadt, Germany | 41966052 | |
| Fluorescence Microscope (Leica DMi8) | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany | 11889113 | |
| Glass block cantiliver holder | Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany | SP-90-05 | Extra long glass block with angled faces, designed especially for the use with the JPK PetriDishHeaterTM (Bruker). |
| Inverted phase contrast microscope (integrated in the AFM) | AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany | L201306_03 | |
| Leibovitz's L-15 medium without L-glutamine | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | F1315 | |
| Microscope glass slides | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | CLS294775X50 | |
| Mounting medium With DAPI | ibidi GmbH, Gräfelfing, Germany | 50011 | Mounting media with nuclear DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) counterstaining used for cartilage discs side view imaging |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | P4333 | |
| Petri dish heater associated with AFM (Petri Dish Heater) | Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany | T-05-0117 | |
| Scalpel | Feather Medical Products, Osaka, Japan | 2023-01 | |
| Silicone Skirt | Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany | n/a | Protective silicone membrane (D55x0.25) which is placed on the basis of the base of the glas block to prevent medium condensation in the AFM head. |
| Statistical program – SPSS | IBM, Armonk, New York, USA | SPSS Statistics 22 | Vesion 280.0.0.0 (190) |
| Tissue culture dishes | TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland | TPP93040 | |
| Tissue-tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands | SA6255012 | Water-soluble embedding medium |
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